李慧圓，雷春陽，黃 燕，聶 舟

（湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)/生物傳感與化學(xué)計量學(xué)國家重點實驗室,湖南省生物大分子化學(xué)生物學(xué)重點實驗室,長沙410082）

新的技術(shù)和研究工具的出現(xiàn)，通?？梢约铀偕踔翉氐赘淖兩飳W(xué)研究.在過去幾十年中，熒光蛋白的出現(xiàn)和最先進(jìn)的顯微技術(shù)使人們進(jìn)入一個可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞分辨率下觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和原位實時監(jiān)測多種生理、病理過程的全新階段［1］.其中，來自維多利亞多管水母（Aequorea victoria）的野生型綠色熒光蛋白（Wild-type green fluorescent protein，wtGFP）是第一個被克隆并進(jìn)行表達(dá)的熒光蛋白［2］.wtGFP因其獨特的性質(zhì)和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)吸引了大量科研工作者對其開展相應(yīng)的研究.鑒于熒光蛋白在現(xiàn)代生命科學(xué)研究中的重要性，在熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用過程中做出杰出貢獻(xiàn)的3位科學(xué)家Osamu Shimomura，Martin Chalfie和Roger Y.Tsien被授予了2008年諾貝爾化學(xué)獎［3］.

1955年，Davenport和Nicol［4］首次發(fā)現(xiàn)Aequorea victoria在紫外光照射下可以發(fā)出綠色的熒光.1962年，Shimomura等［5］在這類水母中首次發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白（GFP）.他們進(jìn)一步通過木瓜蛋白酶將GFP水解成多肽片段，并分離、純化含有生色團(tuán)的多肽，推測出GFP生色團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-對羥基苯甲基-5-咪唑啉酮［4-（p-hydroxybenzylidene）-5-imidazolinone，p-HBI］［6］. 此時，研究者并未意識到GFP的巨大應(yīng)用潛力.1992年，Prasher等［7］克隆并測序確定了wtGFP的cDNA序列，科學(xué)家們開始意識到它的重大意義.1994年，Chalfie等［8］實現(xiàn)了GFP在異源生物體線蟲中的表達(dá)，開啟了GFP作為熒光遺傳標(biāo)簽的時代.Tsien［9］是第一位致力于熒光蛋白改造的科學(xué)家，他和團(tuán)隊通過定點突變和隨機突變獲得了新的GFP衍生物，并闡述了GFP的發(fā)光機制，為同時追蹤多個生理事件提供了有力的技術(shù)支持.1999年，Matz等［10］從珊瑚蟲中發(fā)現(xiàn)并分離出編碼紅色熒光蛋白（DsRed）的基因.雖然DsRed是一種不利于與其它蛋白進(jìn)行融合表達(dá)的四聚體蛋白，但這一發(fā)現(xiàn)仍是鼓舞人心的.2002年，Campbell等［11］通過定向進(jìn)化的方式在DsRed的基礎(chǔ)上得到了單體紅色熒光蛋白（mRFP1）.在眾多科學(xué)家的努力下，目前已報道的熒光蛋白的熒光光譜涵蓋了整個可見光區(qū)乃至近紅外區(qū)域，為活細(xì)胞內(nèi)可視化和量化各種蛋白和生理事件提供了豐富的工具［1］.

對熒光蛋白分子結(jié)構(gòu)的解析為揭示其發(fā)光機制及更廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ).wtGFP包含238個氨基酸，分子量約27000.晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)是由11個β-折疊圍繞著沿中心軸延伸的α-螺旋組成的桶狀結(jié)構(gòu)（β-桶），α-螺旋上的三肽（Ser65-Tyr66-Gly67）通過自催化分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)生成生色團(tuán).生色團(tuán)被封裝在桶狀結(jié)構(gòu)的中心，短的α-螺旋段蓋住桶的兩端，有助于將生色團(tuán)與溶劑隔離開.生色團(tuán)的成熟包括折疊-環(huán)化-脫水-氧化4個過程，除O2外不需要其它輔因子.最初的折疊步驟至關(guān)重要，只有當(dāng)GFP多肽鏈正確折疊成穩(wěn)定的天然構(gòu)型時，才能進(jìn)行下一步的生色團(tuán)形成［12］.

通過對熒光蛋白結(jié)構(gòu)和成熟過程的深入探究，越來越多的研究者著手對熒光蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新設(shè)計，賦予其新的功能和性質(zhì)，這進(jìn)一步促進(jìn)了熒光蛋白的發(fā)展與應(yīng)用.本文將系統(tǒng)介紹通過局部結(jié)構(gòu)改造、桶狀結(jié)構(gòu)重構(gòu)、表面重構(gòu)和結(jié)構(gòu)模擬等結(jié)構(gòu)設(shè)計方法實現(xiàn)對GFP功能的改變和模擬，并且介紹不同結(jié)構(gòu)改造方法獲得的熒光蛋白在生物傳感方面的代表性應(yīng)用，為探究其它熒光蛋白的改造及在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了設(shè)計思路.

1 局部結(jié)構(gòu)改造

wtGFP具有復(fù)雜的光譜性質(zhì)（λex：397 nm/λem：508 nm，λex：476 nm/λem：503 nm）以及低的量子產(chǎn)率，嚴(yán)重限制了其在生物成像方面的應(yīng)用［13］.科學(xué)家們希望可以獲得更明亮、更穩(wěn)定以及不同顏色的熒光蛋白（圖1）.最初，較廣泛的嘗試是通過定點突變技術(shù)對wtGFP進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，來探究是否可以使用不同的氨基酸對特定位點進(jìn)行替換以調(diào)整其光譜特征.

Fig.1 Schematic representation of the fluorescent protein mutants

Tsien［9］通過定點突變的方法首先對臨近wtGFP生色團(tuán)位置的氨基酸進(jìn)行突變，獲得了一系列發(fā)射光譜位于藍(lán)色到黃色區(qū)域的熒光蛋白突變體，包括藍(lán)色熒光蛋白（BFP和GFP Y66H，λex：380 nm/λem：448 nm）［14］、青色熒光蛋白（CFP和GFP Y66W，λex：380 nm/λem：448 nm）以及黃色熒光蛋白（YFP，GFP S65T和T203H，λex：512 nm/λem：524 nm）［15］. 不同顏色的熒光蛋白突變體為多色成像以及構(gòu)建基于熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）傳感器提供了可能.Rizutto等［16］首次使用BFP和GFP S65T對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了雙重標(biāo)記.Tsien課題組［17］完成了第一個基于熒光蛋白的FRET實驗，而后成功獲得了檢測Ca2+的FRET傳感器cameleons［18］.這一突破性的設(shè)計可以監(jiān)測單個細(xì)胞中游離Ca2+的信號，表明基于熒光蛋白的FRET生物傳感器在細(xì)胞成像中具有廣泛的應(yīng)用潛力.CFP/YFP組合是迄今為止絕大多數(shù)基于熒光蛋白FRET生物傳感器的報告元件，被用于蛋白激酶活性、caspase-3活性、鈣離子、鋅離子及稀土元素等的檢測［19～23］.除了通過突變獲得多色熒光蛋白外，研究者也在尋找與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）具有相似性能的紅色熒光蛋白.Campbell等［11］通過定向進(jìn)化替換了DsRed中的33個氨基酸，獲得mRFP1.此后，科學(xué)家們進(jìn)一步獲得了“mFruit”系列的熒光蛋白，其中包括mOrange，tdTomato，mStrawberry，mCherry和mPlum等熒光蛋白［24］.這些多色熒光蛋白突變體的出現(xiàn)很好地補充了wtGFP突變體成像區(qū)域的空白.

此外，通過定點突變技術(shù)對特定位點氨基酸進(jìn)行替換也可有效改善熒光蛋白的折疊效率，提高GFP在不同的異源細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)效率［25］. 如，GFP S65T（λex：489 nm/λem：510 nm）穩(wěn)定了發(fā)色團(tuán)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，亮度提高約5倍，成熟速度提高約4倍，改善了GFP作為報告蛋白存在的限制［13］.EGFP（GFP S65T和F64L）在37℃時的成熟效率極高［26］，在生物成像領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用［27］.Waldo課題組［28］對wtGFP的16個氨基酸殘基進(jìn)行突變，獲得了超折疊綠色熒光蛋白（sfGFP）.sfGFP具有更加穩(wěn)定的熒光性質(zhì)，即使與不溶性蛋白融合也能折疊，為后續(xù)熒光蛋白的結(jié)構(gòu)設(shè)計和改造奠定了基礎(chǔ).

許多熒光蛋白的光物理特性非常復(fù)雜，可能涉及幾種不同的發(fā)射和非發(fā)射狀態(tài)，以及在單個分子水平上觀察到的開關(guān)“閃爍”行為［29］.在wtGFP及其增強型突變體中，研究者首次觀察到了光敏現(xiàn)象，為研究活細(xì)胞成像中蛋白質(zhì)動力學(xué)過程提供了有利工具［30］，使對目標(biāo)蛋白進(jìn)行精確的光標(biāo)記和跟蹤成為可能.如，光激活變體PA-GFP（GFP H203T）在413 nm光預(yù)照射下會發(fā)生光轉(zhuǎn)換，從而在488 nm光激發(fā)下具有更明顯的光學(xué)對比度（增加約100倍的綠色熒光），可以實現(xiàn)對標(biāo)記蛋白移動的直接觀察且有效避免了新合成熒光蛋白的信號干擾［31］.源自墨綠多管水母（Aequorea coerulescens）的aceGFP的光轉(zhuǎn)換突變體PS-CFP在405 nm光照射下會從青色（468 nm）轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光（511 nm），很好地解決了光激活突變體在激活前無法確定激活區(qū)域的問題，成功用于活細(xì)胞中多巴胺轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運研究［32］.隨后，一些研究小組通過定點突變技術(shù)也發(fā)展了一系列基于紅色熒光蛋白的光敏蛋白突變體，包括光激活紅色熒光蛋白PA-mRFP1、mCherry可光活化變體及Dendra等，為活細(xì)胞的多色光激活標(biāo)記和超分辨率顯微鏡研究儲備了工具［33～35］.

目前，對常用的熒光蛋白大多通過定點突變和定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)行局部結(jié)構(gòu)改造，以改善熒光蛋白的光譜特性、光穩(wěn)定性、成熟效率和亮度，提高了這類蛋白用于細(xì)胞成像的適用性.但這種方式通常具有較大的隨機性，需要構(gòu)建較多的突變體并且需要經(jīng)過大量篩選以獲得最終具有良好性質(zhì)的熒光蛋白.

2 結(jié)構(gòu)重構(gòu)

蛋白質(zhì)需要完整的結(jié)構(gòu)和正確的折疊才能獲得相應(yīng)的生物學(xué)功能.許多蛋白被劈裂成2個片段后，通過復(fù)合還可以重新形成具有生物學(xué)功能的復(fù)合物，包括泛素、β-半乳糖苷酶和二氫葉酸還原酶等［36～38］.Richards［39］最早發(fā)現(xiàn)牛胰核糖核酸酶被枯草桿菌蛋白酶切割后形成的多肽和殘留蛋白具有較低的活性（不到酶原始活性的5%），當(dāng)多肽和殘留蛋白混合后，能重新復(fù)合為具有功能的復(fù)合體，據(jù)此首次構(gòu)建了基于酶的蛋白互補對.

隨著對熒光蛋白的結(jié)構(gòu)-功能的深入研究，除了通過突變的形式對熒光蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造之外，研究者還通過結(jié)構(gòu)重構(gòu)的方式對熒光蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了重排和重組.如通過循環(huán)重排對其C，N端位置進(jìn)行重新設(shè)置、在特定位點插入外來片段或進(jìn)行劈裂后再進(jìn)行復(fù)合，熒光蛋白均可以正確地折疊并發(fā)出熒光.1999年，Baird課題組［40］通過循環(huán)重排研究了GFP的突變體（ECFP，EYFP和EGFP），對EGFP的所有位點進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)10個可以進(jìn)行切割的位點，分別位于第7，8和11個β-鏈，或者位于7和8，8和9β-鏈之間的loop區(qū)域.這些位點的循環(huán)重排或外源多肽的插入不會影響GFP的光譜性質(zhì)，也成為后來結(jié)構(gòu)重構(gòu)中分割熒光蛋白的位點.其中，熒光蛋白結(jié)構(gòu)重構(gòu)中最初代表性的技術(shù)就是雙分子熒光互補技術(shù)（BiFC）.Regan課題組［41］最早實現(xiàn)了基于GFP的蛋白互補.他們將1個GFP突變體（sg100）在蛋白的第7和第8個β-鏈loop區(qū)域進(jìn)行分割，產(chǎn)生2個大小相近的片段（N-GFP和C-GFP）；分割后的GFP片段只有通過具有強烈相互作用的反平行亮氨酸拉鏈的作用才能重新組裝成完整的GFP并發(fā)出熒光.之后，Kerppola課題組［42］提出了BiFC的概念，對GFP和其它顏色的GFP突變體的BiFC現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并通過多色BiFC同時鑒定了多種活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的相互作用［43］.基于BiFC的檢測具有簡單直觀的特點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物大分子間相互作用的可視化檢測［44，45］.然而，最初得到的BiFC體系對溫度很敏感.此外，蛋白大片段與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)時，可能會影響融合蛋白的正確折疊［46，47］.

在sfGFP的基礎(chǔ)上，Waldo等［48］在10和11β-鏈loop區(qū)域確定了一個合適的切割位點，發(fā)展了“10+1”分裂體系.相對于“7+4”和“8+3”體系，“10+1”體系不需要借助外界的相互作用即可自發(fā)復(fù)合且不影響融合蛋白的折疊.他們進(jìn)一步用該體系實現(xiàn)了對蛋白可溶性表達(dá)的評估.在此基礎(chǔ)上，Brock等［49］基于“10+1”體系開發(fā)了一種可視化分析穿膜肽內(nèi)吞過程的分析方法.Ozawa課題組［50］開發(fā)了一種可視化檢測活體內(nèi)細(xì)胞凋亡的蛋白探針，通過基因工程將GFP11小片段與細(xì)胞凋亡有關(guān)的Smac蛋白進(jìn)行融合［圖2（A）］.當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時，帶有GFP11小片段的Smac蛋白被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動細(xì)胞凋亡機制，同時GFP1-10蛋白通過載體質(zhì)粒在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，將會與釋放出來的Smac蛋白上的GFP11發(fā)生復(fù)合重構(gòu)而產(chǎn)生熒光信號，從而實現(xiàn)可視化監(jiān)測細(xì)胞凋亡過程.

Fig.2 Representative applications of split fluorescent protein in biosensing

“10+1”分裂體系有效地補充了熒光蛋白結(jié)構(gòu)重構(gòu)策略，并且小片段標(biāo)記對目標(biāo)蛋白的折疊效率和溶解度影響不大.將GFP11與目標(biāo)蛋白的N或C末端融合表達(dá)，通過GFP1-10和GFP11的自組裝，可以實現(xiàn)目的蛋白的標(biāo)記［48］.此外，小片段還可以通過多肽固相合成的方法獲得，序列可設(shè)計性強，且容易引入化學(xué)修飾，大大拓展了“10+1”分裂體系的應(yīng)用范圍.基于此，我們［51］設(shè)計了基于半合成熒光蛋白功能化的FRET探針（FPAP）［圖2（B）］.連有小分子FRET受體和蛋白酶底物序列的GFP11可以和GFP1-10片段自發(fā)復(fù)合，形成的探針通過GFP1-10片段上修飾的膜插入肽（MIP）錨定在活細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜上的目標(biāo)酶通過切割底物序列釋放出小分子FRET受體，從而實現(xiàn)對活細(xì)胞膜上弗林蛋白酶催化反應(yīng)動態(tài)過程的原位實時成像.此外，我們［52］還提出了一種基于羧肽酶的磷酸化保護(hù)半合成GFP自組裝的策略，實現(xiàn)了對蛋白激酶活性的檢測.化學(xué)合成的s10包括GFP10片段和磷酸化底物多肽，蛋白激酶催化的底物磷酸化可以保護(hù)GFP10片段不被羧肽酶切割，使其可以與帶有成熟生色團(tuán)的截短蛋白（tGFP）自組裝并恢復(fù)生色團(tuán)熒光，呈現(xiàn)比傳統(tǒng)分裂GFP系統(tǒng)更快的熒光互補和更高的信倍比.

Waldo課題組［53］進(jìn)一步對雙分裂體系進(jìn)行改造，設(shè)計了三分裂GFP體系.該體系包括GFP1-9，GFP10和GFP11三個部分（9+1+1），三者不能自發(fā)復(fù)合形成完整的GFP.只有當(dāng)GFP10和GFP11片段因伴侶蛋白之間的相互作用而靠攏時，才會與GFP1-9大片段發(fā)生復(fù)合形成具有完整結(jié)構(gòu)的GFP，并伴隨熒光信號的產(chǎn)生.三分裂GFP體系同樣能夠檢測蛋白-蛋白相互作用［54］.Cabantous等［55］基于三分裂GFP體系開發(fā)了小G蛋白（GTPase）及其效應(yīng)因子相互作用的傳感器，實現(xiàn)了對GTPase激活調(diào)節(jié)因子的高通量篩選.同樣的，三分裂體系中的小片段也具有不干擾目的蛋白折疊、易于設(shè)計的特點.我們［56］建立了一種基于三分裂GFP體系的轉(zhuǎn)肽酶活性檢測新方法［圖2（C）］.化學(xué)合成的GFP10和GFP11片段包含轉(zhuǎn)肽酶識別序列，在轉(zhuǎn)肽酶的催化下通過轉(zhuǎn)肽反應(yīng)形成GFP10-11片段，從而與GFP1-9復(fù)合形成完整的GFP并伴隨產(chǎn)生熒光信號.該方法無需標(biāo)記且靈敏，其簡單的“一鍋法”操作過程可用于實際樣品中金黃色葡萄球菌的檢測.近期，Shu等［57］設(shè)計了一種名為FlipGFP的蛋白酶活性傳感器，按GFP10，E5，GFP11，蛋白酶的切割序列和K5的順序依次將這些多肽進(jìn)行融合并表達(dá)，異二聚線圈E5和K5的作用反轉(zhuǎn)了GFP11相對于GFP10的方向，產(chǎn)生具有同向平行結(jié)構(gòu)的GFP10-GFP11鏈.當(dāng)?shù)鞍酌盖懈钚蛄泻罂蛇€原GFP11與GFP10的反平行結(jié)構(gòu)，并與GFP1-9結(jié)合并恢復(fù)熒光，從而實現(xiàn)蛋白酶活性的靈敏檢測.作者將TEV切割序列插入到FlipGFP中，在TEV切割序列后獲得77倍的熒光變化；通過將切割序列更換為caspase-3的切割序列，實現(xiàn)了對細(xì)胞凋亡過程的監(jiān)測.

對熒光蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)重構(gòu)的方法為研究生物大分子相互作用提供了新思路.但劈裂位點的選擇、復(fù)合之后熒光蛋白熒光強度以及成熟速率的提高還需要進(jìn)一步研究.

3 表面重構(gòu)

蛋白表面重構(gòu)是通過計算機模擬和遺傳改造的方法對蛋白質(zhì)表面進(jìn)行重新設(shè)計，可在不破壞蛋白質(zhì)原有功能和性質(zhì)的基礎(chǔ)上，擴展蛋白質(zhì)的功能和性質(zhì)［58］.Liu等［59］通過表面重構(gòu)策略對GFP進(jìn)行改造，探究了蛋白抗聚集性與表面凈電荷之間的關(guān)系.他們將sfGFP中的表面氨基酸殘基突變成精氨酸/賴氨酸（Arg/Lys）或谷氨酸/天冬氨酸（Glu/Asp），獲得了理論上帶大量凈電荷（正/負(fù)）的超電荷熒光蛋白（ScGFP），并成功在大腸桿菌中表達(dá)出這些蛋白.實驗結(jié)果表明，ScGFP擁有和起始GFP相似的光物理性質(zhì)，并且具有抗聚集和強大的熱穩(wěn)定性等優(yōu)異性質(zhì).

ScGFP對帶相反電荷的大分子表現(xiàn)出強大、可逆的親和力，這類似于組蛋白與帶相反電荷的DNA的天然組裝［60］.受DNA/組蛋白復(fù)合物自然裝配行為的啟發(fā)，我們［61］將+36 GFP和帶負(fù)電的DNA通過靜電相互作用組裝形成聚離子復(fù)合物，開發(fā)了一種基于+36 GFP/DNA聚離子復(fù)合物和支點介導(dǎo)鏈取代反應(yīng)的生物傳感新方法［圖3（A）］.該方法中，雙鏈DNA探針包含長鏈（L）和短鏈（S），S鏈尾部用有機猝滅劑BHQ1進(jìn)行修飾.當(dāng)BHQ1-DNA與+36 GFP形成納米復(fù)合物時，前者通過能量轉(zhuǎn)移高效猝滅+36 GFP的熒光.當(dāng)與L鏈完全互補的靶DNA（T1）存在時，會與探針發(fā)生支點介導(dǎo)的鏈置換，從而釋放BHQ1標(biāo)記的S鏈，并恢復(fù)+36 GFP熒光；當(dāng)目標(biāo)鏈中含有突變位點時，鏈取代不會發(fā)生，熒光不能恢復(fù)，從而構(gòu)建了一個用于基因診斷的簡便通用的平臺.與分子信標(biāo)探針相比，基于ScGFP的DNA分析顯示出高靈敏度和更好的堿基錯配區(qū)分能力，可應(yīng)用于癌癥病人組織樣品中目標(biāo)基因甲基化程度的快速檢測.ScGFP除了可以與帶負(fù)電的核酸發(fā)生相互作用之外，還可以與其它材料發(fā)生相互作用.通過研究DNA保護(hù)的+36 GFP與石墨烯（GO）的相互作用，我們［62］開發(fā)了DNA損傷相關(guān)酶活性檢測的新方法，實現(xiàn)了尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDGs）堿基切除修復(fù)酶的活性和抑制劑的分析檢測.我們［63］還發(fā)展了基于+36 GFP與陽離子聚合物共振能量轉(zhuǎn)移的熒光策略，實現(xiàn)了對多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP-1）活性和抑制劑的高靈敏檢測分析.同樣，Li等［64］基于糖胺聚糖（GAG）劑量依賴性地抑制GO對+36 GFP的熒光猝滅效應(yīng)，實現(xiàn)了從分子水平到細(xì)胞水平甚至活體的復(fù)雜生物樣品中GAG的檢測和成像.相對于需要遺傳構(gòu)建的傳統(tǒng)生物傳感器，基于ScGFP構(gòu)建的生物傳感方法具有方便快捷、靈敏以及響應(yīng)機制多樣化的特點.

許多陽離子型遞送載體通常會與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的成分結(jié)合，并通過胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞，如HIV Tat細(xì)胞穿透肽和有陽離子區(qū)域的工程蛋白等［65，66］.研究者推測+36 GFP也可能與細(xì)胞膜的負(fù)電荷成分締合從而穿透細(xì)胞.Liu等［67，68］驗證了+36 GFP穿透細(xì)胞的能力，并進(jìn)一步用+36 GFP將核酸和蛋白質(zhì)遞送到各種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，包括對陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染具有抗性的細(xì)胞系.+36 GFP很好地解決了大多數(shù)遞送方法存在的普遍性問題，如細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性等，提供了一種高效無毒快速的生物大分子遞送方法.

Fig.3 Representative applications of the surface reconstructed fluorescent proteins in biosensing and protein delivery

盡管+36 GFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)運效率高，但通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞的大多數(shù)蛋白仍被包裹在囊泡內(nèi)，不是被溶酶體降解，就是再次被排出細(xì)胞，真正釋放發(fā)揮作用的蛋白比較少.Liu等［60］通過表面重構(gòu)的方法進(jìn)一步對+36 GFP進(jìn)行改造，將Arg/Lys突變位點替換成組氨酸（His），獲得了表面帶39個His殘基的GFP（H39GFP），并且發(fā)現(xiàn)pH可以調(diào)節(jié)H39GFP表面所帶的電荷量.我們［69］基于H39GFP表面電荷可調(diào)的性質(zhì)構(gòu)建了H+和金屬離子觸發(fā)的細(xì)胞邏輯門，用于核酸分子的智能遞送，實現(xiàn)了條件可控的siRNA胞內(nèi)遞送及細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的下調(diào).在此基礎(chǔ)上，我們［70］設(shè)想通過調(diào)節(jié)His與Arg/Lys的比例，將富含His的GFP設(shè)計成準(zhǔn)確響應(yīng)目標(biāo)pH的蛋白載體.根據(jù)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的pH值，通過表面重構(gòu)進(jìn)一步設(shè)計獲得了His29GFP，該蛋白可以區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞微環(huán)境的微弱pH差異［圖3（B）］.His29GFP在目標(biāo)pH=6.5時可選擇性滲透細(xì)胞，并高效地從溶酶體中逃逸，從而將核糖核酸酶A（RNase A）遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，降解mRNA并引起細(xì)胞死亡.近期，我們［71］還將H39GFP與納米材料結(jié)合，構(gòu)建了蛋白藥物負(fù)載量高（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞63%）以及可實時監(jiān)控蛋白藥物釋放的熒光/核磁雙模成像的“納米餃子”［圖3（C）］.融合了蛋白藥物的His39GFP通過金屬離子和組氨酸的作用引導(dǎo)蛋白自組裝形成復(fù)合物作為“餃子餡”，在其表面通過二氧化錳（MnO2）的原位生物礦化形成“餃子皮”，進(jìn)一步通過葉酸修飾的聚乙二醇（PEG-FA）進(jìn)行功能化，獲得主動靶向癌細(xì)胞的蛋白遞送“納米餃子”.MnO2納米材料廣泛的光吸收能力使其能夠通過能量轉(zhuǎn)移猝滅His39GFP的熒光，內(nèi)涵體/溶酶體內(nèi)還原性和酸性微環(huán)境的雙刺激可以破壞MnO2納米層，釋放大量帶有His39GFP標(biāo)簽的蛋白藥物和Mn2+.結(jié)合蛋白載體和納米材料載體的特性，該工作提出了一種高效智能的自報告蛋白遞送新方法，實現(xiàn)了蛋白藥物的高效靶向遞送，并通過熒光/磁共振成像（MRI）對蛋白藥物的釋放過程進(jìn)行實時跟蹤，對于提高抗腫瘤蛋白藥物的靶向性和藥效具有重要的理論和應(yīng)用價值.此外，利用H39GFP具有的金屬離子配位性質(zhì)，我們［72］設(shè)計了一種免標(biāo)記檢測Cu2+的傳感方法，實現(xiàn)了對Cu2+的快速、簡便和特異性檢測.在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了基于His39GFP/Cu2+檢測乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的傳感策略.

通過表面重構(gòu)對熒光蛋白進(jìn)行改造，可以賦予熒光蛋白獨特的性質(zhì)，豐富其在生物傳感等生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用.表面重構(gòu)的設(shè)計策略需要通過合適的方法篩選出可以突變的表面位點.與掩埋殘基相比，溶劑暴露的氨基酸通常被認(rèn)為對穩(wěn)定折疊狀態(tài)的貢獻(xiàn)較小，但需要注意的是，無論溶劑暴露程度如何，側(cè)鏈都可能在某些蛋白質(zhì)的表達(dá)和折疊中發(fā)揮重要作用.

4 結(jié)構(gòu)模擬

化學(xué)合成的熒光蛋白生色團(tuán)HBI幾乎沒有熒光，這與在變性的GFP中觀察到的熒光響應(yīng)的快速消失一致.然而，一旦GFP重新折疊，熒光就會恢復(fù).因此，生色團(tuán)周圍的環(huán)境對于熒光蛋白保持熒光至關(guān)重要［73，74］.在GFP生色團(tuán)附近存在著大量含有極性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸殘基，這些側(cè)鏈與生色團(tuán)形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而限制生色團(tuán)的分子內(nèi)運動，使熒光成為消耗激發(fā)態(tài)生色團(tuán)能量的主要途徑［75］.

受GFP結(jié)構(gòu)和生色團(tuán)發(fā)光機理的啟發(fā)，研究者利用超分子宿主、金屬有機框架、蛋白質(zhì)和核酸模擬了GFPβ-桶的自然限制作用來限制生色團(tuán)的分子內(nèi)運動，從而實現(xiàn)了GFP生色團(tuán)類似物的熒光激活［76～80］.同時，利用GFP生色團(tuán)類似物，發(fā)展了一系列“turn on”型的傳感器，實現(xiàn)了對離子、核酸和蛋白質(zhì)等目標(biāo)物的檢測［81，82］.

相對于其它熒光蛋白結(jié)構(gòu)模擬物，核酸模擬物除具有易設(shè)計合成的特點外，還為熒光標(biāo)記核酸提供了合適的方法.基于熒光蛋白核酸模擬物的傳感器不僅有效地補充了熒光蛋白傳感器在核酸應(yīng)用領(lǐng)域的不足，也促進(jìn)了核酸在生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用.三苯基甲烷染料，如孔雀石綠（MG），容易發(fā)生振動激發(fā)而通常具有極低的熒光量子產(chǎn)率.2003年，Tsien等［83］證明了MG與核酸適配體結(jié)合時會顯著增加MG的熒光（約2360倍），這一開創(chuàng)性工作催生了可與各種弱熒光分子結(jié)合以增強這些分子熒光的RNA適體的發(fā)展［84～86］.Jaffrey課題組［80］通過篩選對GFP生色團(tuán)類似物具有足夠親和力和選擇性的核酸適配體，開發(fā)了遺傳編碼的“熒光RNA”，得到了一系列光譜跨越可見光區(qū)的RNA-生色團(tuán)復(fù)合物，其中一種叫作菠菜（Spinach）的RNA-生色團(tuán)復(fù)合物發(fā)出的綠色熒光與GFP的亮度相當(dāng).隨后，該課題組［87］將Spinach和目標(biāo)識別適配體結(jié)合，利用目標(biāo)物的結(jié)合誘導(dǎo)調(diào)節(jié)Spinach的結(jié)構(gòu)，使之能與生色團(tuán)類似物3，5-二氟-4-羥基苯甲基咪唑啉酮（DFHBI）結(jié)合并產(chǎn)生熒光，構(gòu)建了在體外檢測各種小分子的變構(gòu)Spinach傳感器，實現(xiàn)了對大腸桿菌中二磷酸腺苷（ADP）和S腺苷甲硫氨酸（SAM）的細(xì)胞內(nèi)水平的動態(tài)變化和細(xì)胞間變化進(jìn)行成像［圖4（A）］.基于此原理，通過對RNA序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新設(shè)計，研究者開發(fā)了分別針對代謝物和蛋白質(zhì)的各種Spinach傳感器［88～91］.

此外，Spinach傳感器也可以對體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行實時監(jiān)測［92］.Ricci等［93］通過對Spinach適體進(jìn)行劈裂，開發(fā)了一種生物分子互補測定法.2條帶有抗原標(biāo)簽的RNA互補鏈與靶抗體結(jié)合后共定位在狹窄的空間中，可以重新組裝成Spinach構(gòu)象，產(chǎn)生抗體濃度依賴的熒光發(fā)射.該方法為Spinach傳感器的設(shè)計提供了新思路.核糖開關(guān)是天然存在的代謝物敏感RNA，對于構(gòu)建傳感器是一個不錯的選擇.Jaffrey課題組［94，95］利用細(xì)菌核糖開關(guān)中的適體，結(jié)合變構(gòu)Spinach傳感器的概念，開發(fā)了另一類基于熒光蛋白RNA模擬物的Spinach核糖開關(guān)，并應(yīng)用于代謝物的檢測.此外，該小組還發(fā)展了其它熒光蛋白RNA模擬物，包括Spinach2、花椰菜（Broccoli）和玉米（Corn）［96～98］.Spinach2在熒光標(biāo)記活細(xì)胞中的RNA方面展現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性，Broccoli和Corn結(jié)合其相應(yīng)的生色團(tuán)類似物后分別顯示綠色和黃色熒光.其中，Broccoli在細(xì)胞成像中顯示出更加穩(wěn)定的折疊和綠色熒光，并且相對于Spinach具有更小的尺寸和更強的熒光.這些熒光蛋白RNA模擬物的出現(xiàn)使得對活細(xì)胞中重要的信使、核糖體和微小RNA的原位熒光標(biāo)記和成像成為可能，從而有助于回答有關(guān)其在活細(xì)胞中的代謝、運輸和功能的許多生物學(xué)問題.

基于熒光蛋白RNA模擬物的生物傳感器能在細(xì)胞中表達(dá)，并表現(xiàn)出與特定細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度成比例的熒光，已被用作代謝產(chǎn)物成像的遺傳編碼RNA傳感器以及合成生物學(xué)應(yīng)用的工具［99］.然而，因為標(biāo)記RNA的快速降解和熱不穩(wěn)定性等原因，這類RNA模擬物在哺乳動物細(xì)胞中的亮度有限.G-四鏈體（G4）是基于Hoogsteen堿基配對的4個G形成的核酸結(jié)構(gòu).研究表明，Spinach具有豐富的鳥苷酸（G）序列，包含一個獨特的G4結(jié)構(gòu)以促進(jìn)生色團(tuán)熒光的激活［100］.基于此，我們［101］合成了一系列紅色熒光蛋白（RFP）生色團(tuán)類似物，并利用DNA G4點亮了這些生色團(tuán)，首次實現(xiàn)了人工手段模擬RFP［圖4（B）］.類似于對天然RFP生色團(tuán)結(jié)構(gòu)的限制，DNA G4為RFP生色團(tuán)類似物的堆疊提供了理想的封裝位點，并將它們限制在平面構(gòu)象中以實現(xiàn)高效發(fā)射，激活紅色和偏遠(yuǎn)光譜區(qū)域（λem=583～668 nm）的明亮熒光.與RFP相比，RFP的DNA模擬物具有明亮的紅色發(fā)光、大的斯托克斯位移、抗光漂白和雙光子熒光特性.我們進(jìn)一步將該模擬物用于活細(xì)胞膜蛋白的標(biāo)記，實現(xiàn)了膜蛋白的長時間示蹤和雙光子組織成像.

開發(fā)模擬天然熒光蛋白的合成材料，對于闡明熒光蛋白的發(fā)光機制和創(chuàng)造新的熒光響應(yīng)工具和生物傳感器至關(guān)重要.生色團(tuán)骨架和核酸結(jié)構(gòu)的可設(shè)計性在構(gòu)建不同熒光蛋白的結(jié)構(gòu)模擬物方面具有很大的潛力.同時，也需要進(jìn)一步提高熒光蛋白結(jié)構(gòu)模擬物的亮度和光穩(wěn)定性，并開發(fā)更多的結(jié)構(gòu)模擬物.

Fig.4 Representative applications of fluorescent protein mimics in biosensing

5 總結(jié)與展望

本文對熒光蛋白結(jié)構(gòu)改造和模擬方法及其在生物傳感中的代表性應(yīng)用進(jìn)行了闡述和分析.這些結(jié)構(gòu)改造方法有效地優(yōu)化了熒光蛋白的性質(zhì)，發(fā)展了亮度更高、光穩(wěn)定性、成熟更快以及不同顏色變體的熒光蛋白，賦予了熒光蛋白自組裝、抗聚集等功能，擴展了熒光蛋白在生物傳感、生物成像等領(lǐng)域的應(yīng)用.在這些改造過程中，研究者對于熒光蛋白的結(jié)構(gòu)與發(fā)光機制有了更好的了解，有助于開發(fā)性質(zhì)更優(yōu)且可用于深層組織和全身成像的熒光蛋白工具.通過對熒光蛋白的結(jié)構(gòu)模擬，獲得了人工手段模擬的熒光蛋白類似物，這是一個令人興奮的概念，擴大了相關(guān)的檢測目標(biāo)范圍.目前，仍然需要進(jìn)一步改善熒光蛋白結(jié)構(gòu)模擬物的亮度和光穩(wěn)定性，以實現(xiàn)其在哺乳細(xì)胞內(nèi)的有效成像.另外，基于對GFP的結(jié)構(gòu)研究策略也為探究其它熒光蛋白在生物學(xué)領(lǐng)域中的進(jìn)程提供了設(shè)計思路.