趙關(guān)芳，鄒天一，程思航，于 洋，王慧利，王宏達

（1.中國科學院長春應用化學研究所,電分析化學國家重點實驗室,長春130022;2.中國科學技術(shù)大學,合肥230026）

對生物大分子結(jié)構(gòu)的研究對于全面了解其生物學功能至關(guān)重要，尤其是對結(jié)構(gòu)的可視化對于其功能的理解很關(guān)鍵.而傳統(tǒng)研究生物大分子通常采用“還原論”或“分而治之”的方法：將生物大分子進行分離純化，并通過結(jié)構(gòu)生物學的方法研究純化的成分［1］.X射線晶體學（X-ray crystallography）［2］、核磁共振（NMR）［3］以及可原位成像生物樣品的單分子成像技術(shù)［如原子力顯微鏡（AFM）和單分子熒光顯微鏡（SMFM）］［4，5］成為20世紀研究生物大分子的主要技術(shù).其中，X射線晶體學常被用來確定生物分子的高分辨率結(jié)構(gòu)，通過該方法已經(jīng)得到了多種蛋白和核酸的原子模型［6，7］.但是，該技術(shù)只能確定可以結(jié)晶的生物分子的結(jié)構(gòu)，不能用來確定無法結(jié)晶或者難以結(jié)晶的樣品的結(jié)構(gòu).單分子成像顯微鏡可以在原位生理環(huán)境中對生物樣品進行成像，如本課題組［8，9］通過AFM從細胞膜兩側(cè)系統(tǒng)地分析了原位細胞膜結(jié)構(gòu)，提出了新的細胞膜模型，為研究細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的見解.而通過SMFM能以很高的信噪比可視化樣品中目標分子的分布，同時保留了目標分子在生理環(huán)境中的關(guān)鍵特征.如通過SMFM原位表征活細胞中細胞膜上的單個蛋白等生物分子的分布特征［10，11］.然而，由于單分子成像顯微鏡的分辨率較低，雖然可以通過該方法對生物分子進行原位成像，但無法可視化生物分子的三維結(jié)構(gòu).對于生物系統(tǒng)來說，大多數(shù)的生理功能是多種不同生物分子相互作用的結(jié)果［12］.而且生物分子的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生理功能的執(zhí)行嚴格依賴其所處的生理環(huán)境，在保持生物分子結(jié)構(gòu)完整性的情況下不可能將其從所處生理環(huán)境中分離純化出來.因此，以高分辨率表征生物分子在其原位環(huán)境中的三維結(jié)構(gòu)特征對于了解其功能具有重要的生理學意義.

冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）［13］適用于冷卻至低溫并嵌入玻璃態(tài)冰中的樣品而不需要使樣品結(jié)晶，是唯一能夠在原位生理環(huán)境中直接以多種構(gòu)象可視化生物分子三維結(jié)構(gòu)的成像技術(shù)［14］.電子斷層掃描（ET）是獲取樣品三維結(jié)構(gòu)常用的方法，即通過以一個固定的角度間隔將樣品傾轉(zhuǎn)一定的角度（通常為—60°～+60°），用電子顯微鏡（EM）獲取樣品的投影圖像.在cryo-ET中，通過旋轉(zhuǎn)樣品可以得到不同角度的二維投影圖并對其進一步重構(gòu)處理生成三維的斷層圖.該斷層圖就是包埋有樣品的玻璃態(tài)的冰.然后，可通過識別并分割該斷層圖中感興趣的目標樣品，或通過提取并平均多個同種目標樣品以獲得該樣品的中高分辨率的結(jié)構(gòu)［15］.近年來，隨著硬件技術(shù)的進步（電子檢測器技術(shù)、相位板、能量過濾器等）與樣品制備技術(shù)的改進，cryo-ET才逐漸得到了廣泛應用［16～18］.此外，cryo-ET也是一種強大的無需標記的成像技術(shù)，依靠生物樣品固有的質(zhì)量密度，可以得到生物結(jié)構(gòu)的全面電子密度圖像，因此可對原位的細胞或者細胞內(nèi)部以納米級分辨率進行成像，從而保留每個生物結(jié)構(gòu)的構(gòu)象以及其與其它生物分子相互作用的完整信息.而樣品制備技術(shù)的改進使得cryo-ET可對多種生物樣品進行成像.目前已經(jīng)利用cryo-ET研究了一系列的生物樣品，例如分離的細胞器［19，20］、病毒［21］、細菌［22］、真核細胞［23］和組織切片［24］等.自動化數(shù)據(jù)收集軟件的發(fā)展（serial EM）顯著提高了cryo-ET數(shù)據(jù)的收集效率.強大的數(shù)據(jù)處理工具的出現(xiàn)和計算方法的改進將目標樣品結(jié)構(gòu)的分辨率極限提高到了亞納米水平，如模板匹配（template matching）［25］、襯度傳遞函數(shù)（CTF）校正［26］、子斷層圖平均（sub-tomogram averaging）和分類［27，28］.這使獲得的目標樣品的結(jié)構(gòu)能夠準確反應出其原位環(huán)境中的生理構(gòu)象.

本文從樣品制備和數(shù)據(jù)采集處理與分析等方面綜述了與cryo-ET相關(guān)技術(shù)和方法的進展，總結(jié)了cryo-ET在生物研究中的應用并討論了cryo-ET的主要挑戰(zhàn)及最新進展.

1 Cryo-ET成像流程

1.1 樣品制備

一直以來，用于EM成像的生物樣品必須進行化學固定、脫水和染色.雖然這些步驟對于穩(wěn)定生物樣品的狀態(tài)并提供較好的樣品襯度是必要的，但會嚴重破壞并改變生物樣品的超微結(jié)構(gòu)和分子組織.因此，近幾十年來EM一直無法達到X射線晶體學或NMR的分辨率.然而，隨著快速冷凍樣品保存方法的出現(xiàn)，這種情況發(fā)生了改變，即蛋白質(zhì)水溶液或整個細胞經(jīng)過快速冷凍可生成非晶冰而不是結(jié)晶冰［29，30］，再通過cryo-ET即可以高分辨率觀察近生理環(huán)境中冷凍水合狀態(tài)的生物樣品.目前用于制備cryo-ET冷凍樣品的方法有3種：快速冷凍（PF）［圖1（A）］［31，32］、噴射冷凍（JF）［33］和高壓冷凍（HPF）［圖1（B）］［34］.其中，PF是最常用的技術(shù)，因為它不僅與蛋白質(zhì)復合物、分離的細胞組分以及整個細胞都兼容，而且可以完全自動化［35，36］.HPF則適用于一些較厚或較大的樣品，如多細胞生物或組織，可以使厚度為200 μm的樣品形成玻璃態(tài)［37］.

Cryo-ET成像的一個主要限制因素是樣品厚度.受限于電子的透過能力，cryo-ET對生物樣品進行成像的厚度極限為0.5～1 μm，太厚的樣品很難獲得高分辨率數(shù)據(jù)［38］.因此，最嚴格意義上的原位cryo-ET，即完整生理環(huán)境中的冷凍電子斷層掃描，僅限于足夠薄的生物樣品，如原核生物或真核細胞的外圍部分等.此外，在cryo-ET成像過程中，隨著樣品傾轉(zhuǎn)角度的增大，樣品厚度會明顯增加，這進一步限制了cryo-ET成像的分辨率.因此，在大多數(shù)情況下，需要將生物樣品削薄以滿足cryo-ET對樣品進行高分辨率成像的要求.

通過機械切片來減薄冷凍樣品早在1950年代即已奠定了基礎(chǔ)，但是很久以后才實現(xiàn)了更多的常規(guī)應用.基于玻璃體切片的冷凍電子切片（CEMOVIS）技術(shù)的發(fā)展使cryo-ET首次觀察到了近似處于天然狀態(tài)的細胞.但是，該技術(shù)對操作人員的手動操作能力要求較高，而且通過該技術(shù)得到的樣品質(zhì)量也較差（如外力導致的截面彎曲、劃痕和樣品壓縮）［39，40］.這些因素導致CEMOVIS在cryo-ET高分辨率成像上的應用受到了限制［39］［圖1（C）］.為了克服這些問題，可以采用聚焦離子束（FIB）銑削這種來自材料科學的方法，制備適用于cryo-ET成像的樣品［41～43］［圖1（D）］.FIB銑削在配備用于成像的掃描電子束和用于燒蝕材料的離子束（例如氦、鎵）的雙束顯微鏡上進行.當FIB銑削配備有氮氣溫度下運行的專用平臺時，可以利用這些系統(tǒng)的高精度來制備適用于cryo-ET高分辨成像的生物樣品.使用FIB銑削，可以制備具有不同幾何形狀（“楔形”或“薄片”）和厚度（＜200 nm）的無變形的樣品［44］.此外，雙光束SEM的精確成像特性可對細胞的組分進行相關(guān)成像并精確定位與生物學問題相關(guān)的目標區(qū)域，從而提高樣品通量.FIB銑削不僅可制備分離的細胞薄片，還可制備組織和多細胞生物的薄片［45～47］.

1.2 數(shù)據(jù)采集處理與分析

樣品制備技術(shù)的改進極大地促進了cryo-ET的應用，EM硬件的改進可將ET的分辨率提升到亞納米水平.單顆粒分析（SPA）和cryo-ET密切相關(guān)，因此有許多共同的概念.最近的“分辨率革命”［50］將SPA的分辨率提升到X射線晶體學和NMR水平，其本質(zhì)上是儀器硬件領(lǐng)域的一場革命.這包括能顯著改善顯微鏡的穩(wěn)定性的硬件設備（如透鏡、樣品架）以及能去除非彈性散射電子的能量過濾器［圖2（A）］，這些電子對高分辨率信息沒有幫助.然而，更重要的是，直接電子檢測器（DED）［51］的出現(xiàn)顯著提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量.與傳統(tǒng)的電荷耦合檢測器（CCD）相比，DED的靈敏度顯著提高.此外，DED還具有更快的幀讀取速度，可以在圖像采集過程中校正電子束引起的樣品移動［52］.同時，DED靈敏度的提高可以降低每個角度投影的電子劑量，從而可以總體降低整個傾轉(zhuǎn)系列中的電子累積量.通常，SPA采集數(shù)據(jù)的每個位置曝光的電子總劑量為20～60 e/?2（1?2=0.01 nm2）；但在cryo-ET中，通過繞軸旋轉(zhuǎn)（通常以固定步長從±60°到?60°）［圖2（B）］來獲得樣品在每個角度上的投影圖［圖2（C）］. 因此，需要在整個傾轉(zhuǎn)系列上合理分配樣品可以承受的電子劑量，以避免輻射損傷.為了在整個傾轉(zhuǎn)系列上合理分配樣品可承受的電子劑量，根據(jù)對數(shù)據(jù)要求的不同，研究者提出了幾種不同的樣品臺傾轉(zhuǎn)方式（單向旋轉(zhuǎn)、雙向旋轉(zhuǎn)和對稱旋轉(zhuǎn)）.因此，相比于SPA成像收集的數(shù)據(jù)，cryo-ET成像收集的數(shù)據(jù)中每個角度的圖像承受的電子劑量更低，襯度更低，信噪比（SNR）較差.若樣品不經(jīng)過染色等過程會導致其在cryo-ET成像過程中SNR較差，因此需要通過調(diào)整散焦值來提高樣品的SNR，但是調(diào)整散焦值會降低cryo-ET收集數(shù)據(jù)的分辨率，并且需要通過CTF校正散焦對cryo-ET圖像的影響［53］.因此，為了提高cryo-ET圖像的SNR，可在cryo-ET成像過程中插入相位板［54］，尤其是電壓相位板（VPP），在成像過程中會顯著提高樣品的襯度和SNR，在SPA成像和cryo-ET成像領(lǐng)域均顯示出巨大的潛力.通過相位板增強樣品的襯度和SNR對于cryo-ET成像尤為重要，因為它不僅可以用來確定小分子（＜100 kDa）的結(jié)構(gòu)，而且無需校正調(diào)整散焦值對圖像帶來的混雜效應［55］.

隨著計算機算法的快速發(fā)展，研究人員研發(fā)了各種算法和程序用來重構(gòu)和處理cryo-ET數(shù)據(jù)（如IMOD和TOM等）［57～59］.在cryo-ET數(shù)據(jù)的重構(gòu)過程中，首先需要對傾轉(zhuǎn)系列中每個角度的投影圖進行對齊.通常是追蹤在樣品快速冷凍前吸附在樣品上的高密度基準標記（如金納米顆粒）來對齊傾轉(zhuǎn)系列中各個角度的投影圖.但是這些高密度基準標記不僅無法應用在FIB切割的薄片上［46］，而且可能會降低樣品的質(zhì)量或損害樣品的完整性.因此，在此情況下可以使用碎片追蹤的方法來對傾轉(zhuǎn)系列中的圖像進行對齊，該方法將傾轉(zhuǎn)系列中的圖像分割成碎片，然后計算不同圖像中碎片的互相關(guān)性以校正圖像間的相對位置來進行對齊.因此，這種方法通常不如基準標記追蹤精確，尤其是在傾轉(zhuǎn)系列中傾轉(zhuǎn)角較高或圖像的SNR太低的情況下，碎片追蹤可能容易出錯，這會嚴重影響重構(gòu)后圖像的分辨率.傾轉(zhuǎn)系列中的圖像對齊后，可以使用直接傅里葉反演來重構(gòu)生成斷層圖像.除了傅里葉合成外，還有幾種用于重構(gòu)的迭代算法，如同時迭代重建技術(shù)（SIRT）或同步代數(shù)重構(gòu)技術(shù)（SART）［60，61］.但是，cryo-ET數(shù)據(jù)重構(gòu)最常用的算法是非迭代加權(quán)反投影（WBP），因為它可以最大程度地保留樣品的高分辨率信息［圖2（D）］.通過WBP重構(gòu)得到的三維的斷層圖非常精細，可以手動或半自動標記斷層圖中較大的感興趣的目標結(jié)構(gòu)（如膜或細胞器）.

Fig.2 Principles of data collection and processing in cryo?ET[14,56]

在對cryo-ET數(shù)據(jù)進行三維重構(gòu)生成斷層圖后，需要對斷層圖中目標結(jié)構(gòu)進行識別和挑選.對于較大的分子復合物（如核糖體和蛋白酶體）來說，在斷層圖中很容易被識別，可手動識別并標注其位置.但是這種方法不適用于較大的數(shù)據(jù)集，因此，為了批量處理較大的數(shù)據(jù)集，研究人員研發(fā)了一些功能強大的全自動圖像處理算法，這些算法可根據(jù)目標分子的結(jié)構(gòu)特征和大小自動識別和定位斷層圖中的目標分子.對于通過cryo-ET成像的純化大分子，可使用模板匹配的算法快速識別定位斷層圖中目標分子（如pytom）［圖3（A）］［62，63］. 模板匹配是在斷層圖中搜索定位目標分子復合物的計算方法［64］，使用目標分子的已知結(jié)構(gòu)信息（如晶體結(jié)構(gòu)、分子的粗糙形態(tài)或已知的結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)）通過低通濾波來創(chuàng)建用于自動識別并拾取粒子的模板.此外，也可通過斷層圖直接生成模板.模板匹配算法是將創(chuàng)建或生成的目標結(jié)構(gòu)的模板與斷層圖中的每個位置進行比較，該算法通過運行互相關(guān)計算會生成模板與斷層圖中每個位置的一個互相關(guān)值，因此斷層圖中的每個像素點都會得到一個對應的相似度得分.然后，可從斷層圖中提取與高相似度分值相對應的子斷層圖，并在進一步分析前手動對這些子斷層圖進行篩選，以消除明顯的假陽性結(jié)果［63］.然而，對這些子斷層圖進行分類比較困難.盡管模板匹配的算法可以手動清除明顯的假陽性的子斷層圖，但在處理尺寸較小、特征比較差的異質(zhì)性顆粒數(shù)據(jù)集時結(jié)果通常不理想.對于這種更復雜的斷層圖，可以使用基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡（CNN）［圖3（B）］［65］的斷層圖標記工具來識別目標結(jié)構(gòu)特征（如EMAN2）［66］.這種神經(jīng)網(wǎng)絡只需很少的人為訓練即可學習各種可能的目標結(jié)構(gòu)特征類型，且其本身的結(jié)構(gòu)是固定的.一旦對CNN進行了訓練以識別某個特征，就可以將其用在通過相似的成像條件得到的斷層圖中以識別標記相同的特征而無需額外的訓練.因此，這種神經(jīng)網(wǎng)絡可以輕易區(qū)分結(jié)構(gòu)的細微差異，如線粒體的雙層膜與其它細胞器的單層膜.該算法主要應用在延伸的細絲（如微管蛋白或肌動蛋白）、膜（彎曲/平面）和呈周期排列的或孤立的大分子等類型的斷層圖中.隨后，可從每個斷層圖中提取CNN識別標記的特定特征的子斷層圖.近年來，深度學習神經(jīng)網(wǎng)絡因其強大的功能而得到廣泛應用［67］.但是，對于膜蛋白等很多與膜相關(guān)的處在原位的生物分子，由于它們之間存在相互作用且處在較復雜的的生理環(huán)境中，故對這些生物分子在生理環(huán)境中的檢測和精確定位變得更加困難.對于這種樣品，可以使用一種無模板的圖像處理軟件（Pyseg）［圖3（C）］［68］來識別定位斷層圖中的目標分子，它改編并擴展了基于離散摩爾斯理論（discrete Morse theory）的現(xiàn)有分割方法，能精確追蹤斷層圖中電子密度的復雜網(wǎng)絡并自動檢測和定位生物分子的位置；且該軟件中的算法還可以定位原位環(huán)境中尺寸比較小的生物分子，這些小分子的尺寸遠遠小于模板匹配的極限.此外，由于沒有模板，該軟件還可以識別并定位異質(zhì)性或處在不同組成和構(gòu)象狀態(tài)的分子復合物.而基于隨機采樣選點或深度學習的無模板采樣方法僅適用于比較大的分子復合物，且在模擬和真實數(shù)據(jù)集上均無法達到該軟件所能達到的分辨率.綜上所述，對于不同的數(shù)據(jù)可以采用不同的軟件和方法在斷層圖識別和定位感興趣的目標分子，并將這些目標分子所對應的子斷層圖提取出來［圖2（E）］.隨后就可以通過角度搜索［63，69，70］或快速旋轉(zhuǎn)匹配（FRM）［71］等方法對這些子斷層圖進行迭代對齊. 每次迭代過程都會對子斷層圖中的目標分子進行平均，從而相對于各個子斷層圖提高目標分子的SNR.

Fig.3 Procedures to identify structures of interest in tomograms

通過子斷層圖的對齊和平均生成高分辨率分子結(jié)構(gòu)的方式有2種：傳統(tǒng)的子斷層圖對齊和平均［72，73］以及每個目標分子和每個傾轉(zhuǎn)角度的精確細化.傳統(tǒng)的方式利用的是現(xiàn)有的子斷層圖對齊和平均的算法.對齊的算法采用的是一種可以很好地適應顆粒尺寸變化的非常有效的分級分層的方法.整個分子結(jié)構(gòu)細化的過程采用類似于SPA中的“gold-standard”算法［74］，并使用傅里葉殼相關(guān)（FSC）評估得到的分子結(jié)構(gòu)的分辨率和測量迭代過程間的收斂程度.這些算法已經(jīng)運用在了Relion中.而另一種方式則不使用子斷層圖，而是使用子傾轉(zhuǎn)系列.當整個傾轉(zhuǎn)系列對齊時，我們假設每個傾轉(zhuǎn)角度的圖像都是剛體的投影.考慮到電子束引起的樣品移動、電荷和輻射損傷所帶來的影響，要使樣品在1 μm的跨度內(nèi)保持整體剛度一致是非常困難的，而且最大可接受的樣品移動偏差要＜1 nm.對于生物樣品來說，局部移動偏差很常見，并且這些移動偏差很可能會導致研究對象在各個傾轉(zhuǎn)角度的圖像內(nèi)未對齊.為了消除這種影響因素，研究者們開發(fā)了一種對每個傾轉(zhuǎn)角度中每個目標分子進行細化的算法，其中對每個傾轉(zhuǎn)角度中的每個目標分子的對齊都進行了單獨的細化并對每個目標分子的質(zhì)量進行評估.實際上，這種方法是子斷層圖平均與傳統(tǒng)SPA的相結(jié)合的產(chǎn)物，其中的一些技術(shù)已經(jīng)運用在了EMClarity中［75］.

通常，SPA處理的樣品非常均一，而原位的cryo-ET由于具有更大程度的可變性和更復雜的背景干擾，可能更具有挑戰(zhàn)性.由于目標分子處在原位環(huán)境中，因此cryo-ET在成像過程中可能會檢測到目標分子大量不同的構(gòu)象或狀態(tài)，所以需要將目標分子分成更多的類.自動對焦的三維分類［63］可以無差別的對斷層圖中的目標分子進行分類，并可分辨目標分子中不同功能或組裝狀態(tài)的細微結(jié)構(gòu)差異.目前，已經(jīng)開發(fā)了一些軟件包，這些軟件包集成并簡化了模板匹配、子圖平均和分類等流程.

盡管取得了上述進步，但cryo-ET成像的分辨率通常比SPA低.目前，只有少數(shù)原位cryo-ET對樣品的成像能夠達到亞納米水平.但是，通過為每個檢測到的目標分子提供其在原位環(huán)境中的信息，可以彌補這種較低的分辨率帶來的不足.由于cryo-ET成像技術(shù)的分辨率跨越了很大的空間數(shù)量級范圍，因此可以與低分辨率的成像技術(shù)結(jié)合使用（如熒光顯微鏡）.綜上所述，隨著有關(guān)cryo-ET數(shù)據(jù)處理的算法和軟件的發(fā)展，cryo-ET不僅可以表征目標分子在其原位環(huán)境中的分布狀態(tài)和特征，而且可以獲得目標分子在其原位環(huán)境中的高分辨率的三維結(jié)構(gòu).

2 Cryo-ET在生物學上的應用

Cryo-ET特別適合以分子分辨率研究天然可變或高度復雜的生物分子結(jié)構(gòu)，特別是表征某些異質(zhì)性的超分子組裝體、多型病毒、細胞器和細胞組分，或表征完整的細胞和組織.

SPA可以用于研究純化的生物分子，使其達到亞納米級的分辨率.但是，該方法需要成千上萬個相同生物分子的平均，因此不能應用于具有獨特結(jié)構(gòu)的大分子.在此情況下，cryo-ET是一種可選擇的技術(shù)，因為它能以幾納米的分辨率直接提供單個大分子的三維圖像.如，通過cryo-ET研究進化趨異的生物和人類患者中與疾病相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)蛋白（TRAP）復合物突變的纖維細胞中的天然轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)，揭示了中心易位子組分的分子結(jié)構(gòu)，增加了我們對膜蛋白的了解，并闡明了TRAP在人類先天性糖基化疾病中的作用［76］.此外，已有報道［77］通過cryo-ET研究分離的軸突提出了正常的和引起原發(fā)性睫狀運動障礙的RSPH1突變型人類呼吸道纖毛的天然三維結(jié)構(gòu)，并揭示了RSPH1突變型纖毛中先前未知的初級缺陷和異質(zhì)次級缺陷.這極大地加深了對纖毛和鞭毛運動以及動力蛋白在此過程中作用機理的了解.純化制劑與全細胞斷層成像的結(jié)合特別有效，通過cryo-ET成像和模板匹配的方法來表征70S核糖體揭示了分離的核糖體、休眠核糖體的二聚體和活性多核糖體的空間組織以及在細胞中的精確定位［78］［圖4（A）］.

Cryo-ET已被廣泛應用于多型病毒的研究，如對包膜病毒（例如牛痘、單純皰疹、流感或人類免疫缺陷病毒）的結(jié)構(gòu)與功能的研究.大量的工作揭示了病毒外殼的結(jié)構(gòu)特征及糖蛋白峰、病毒包膜、基質(zhì)和核糖蛋白之間的相互作用.如通過cryo-ET成像和子斷層圖平均確定了完整病毒和重組核衣殼樣裝配體內(nèi)的埃博拉病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)［79］；而且還通過cryo-ET和CTF校正的子斷層圖平均研究了組裝的未成熟的HIV病毒的主要蛋白Gag晶格的結(jié)構(gòu).子斷層圖平均在該領(lǐng)域具有廣泛的應用，將cryo-ET的分辨率降低至了2 nm以下［80］［圖4（B）］.此外，cryo-ET快速成像提出了一種新的病毒與宿主膜融合的模型，直接成像了血凝素的結(jié)構(gòu)中間體及其在膜融合過程中與膜相互作用的過程，以及伴隨膜融合過程中的病毒的超微結(jié)構(gòu)變化，揭示了病毒體的內(nèi)在化，并闡明了如何通過cryo-ET快速成像研究動態(tài)膜過程［81］.

Fig.4 Some biological applications of cryo?ET

雖然大多數(shù)真核細胞很厚以至于無法通過cryo-ET進行完全研究，但是，從細胞或組織中純化出來的真核細胞器通常足夠薄可以直接進行cryo-ET成像.如利用cryo-ET直接研究來自李氏綜合征患者和正常人的培養(yǎng)成纖維細胞中的線粒體.通過對患者和正常人的線粒體的cryo-ET成像對照分析，發(fā)現(xiàn)ATP合成酶二聚體的損失會導致線粒體cr超微結(jié)構(gòu)的嚴重紊亂，揭示了ATP合成酶在調(diào)節(jié)線粒體cr結(jié)構(gòu)中起到的關(guān)鍵作用［20］.此外，還通過cryo-ET成像技術(shù)與其它技術(shù)的結(jié)合獲得了迄今為止人類核孔復合體最完善的三維模型［82］.

諸如突觸小體（保留大部分功能特征的神經(jīng)末梢）之類的細胞部分也可以在快速冷凍后直接通過cryo-ET進行研究.突觸小體的cryo-ET成像分析揭示了突觸間隙中存在的復雜的復合物，并揭示了突觸前細胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中的作用［83］.對通過進一步分離突觸小體獲得的突觸小泡進行cryo-ET成像，揭示了新的內(nèi)吞突觸小泡的網(wǎng)格蛋白皮層的拓撲結(jié)構(gòu)以及皮層與小泡之間的相互作用.此外，由于神經(jīng)元細胞可以吸附在多孔碳膜支撐的金網(wǎng)上并鋪展開來，樣品厚度滿足cryo-ET成像的要求，所以將cryo-ET與熒光顯微鏡聯(lián)用研究了海馬神經(jīng)元完整的興奮性和抑制性突觸，并直接觀察了處于原位狀態(tài)的突觸和大分子的三維結(jié)構(gòu)，提出了興奮性和抑制性突觸超微結(jié)構(gòu)的更新的觀點［84］［圖4（C）］.

某些黏附的真核細胞外圍的厚度也滿足cryo-ET成像的要求，如可以詳細分析片狀脂蛋白和絲狀偽足中的肌動蛋白的骨架組織，并研究其在細胞黏附中的作用［85，86］.此外，還通過CEMOVIS對諸如肝臟、大腦或皮膚等哺乳動物組織進行了研究，但是與該技術(shù)有關(guān)的困難和外力造成的偽像使其無法廣泛應用于組織樣品.

Cryo-ET可以相對容易地應用于原核細胞.許多細菌都足夠薄，可以在快速冷凍后通過cryo-ET直接成像.大量研究已經(jīng)提供了有關(guān)細菌膜組織、內(nèi)部隔室、化學受體陣列或鞭毛運動的詳細結(jié)構(gòu)解析.如通過cryo-ET和子斷層圖平均得到了新月形芽孢桿菌的表層蛋白的結(jié)構(gòu)，并達到了0.74 nm的分辨率，該結(jié)構(gòu)與通過X射線晶體學得到的結(jié)構(gòu)一致.這項研究將X射線晶體學與cryo-ET以及亞納米分辨率的子斷層圖平均相結(jié)合，跨越了從原子到細胞的不同空間尺度［87］.此外，cryo-ET還可與定量質(zhì)譜結(jié)合用于檢測、計數(shù)和定位人類病原體鉤端螺旋體細胞質(zhì)內(nèi)特定的蛋白質(zhì)復合物，描述了視覺蛋白質(zhì)組學的一種新穎的評分功能，并在實際條件下評估了這種評分功能的性能和準確性，為鑒定和定位完整細菌內(nèi)部的大分子提供了驗證標準［圖4（D）］［88］.

3 總結(jié)與展望

以往，降低樣品復雜性可能是獲得大分子復合物高分辨結(jié)構(gòu)的必要步驟，但樣品制備、數(shù)據(jù)處理以及硬件方面的最新改進使原位cryo-ET得以廣泛應用，致使我們在成像過程中會獲得更多關(guān)于樣品細節(jié)的信息.此外，由于采用了更先進的樣品制備技術(shù)（如FIB銑削），樣品的純化和分級分離已不再是必要的步驟.因此，可以在同一原位生理環(huán)境中以高分辨率對不同的生物分子及其相互作用的整個網(wǎng)絡進行建模.盡管目前已經(jīng)取得了以上進步，但cryo-ET仍有進一步的改進空間.

由于DED相機的發(fā)展在很大程度上提高了成像的分辨率，因此對其進一步的改進似乎更為重要.更高的相機像素密度、靈敏度及更快的幀讀取速度，將會進一步減少樣品的輻射損傷進而保留樣品的更多高分辨率信息.同時，硬件儀器的進步將需要對控制顯微鏡和執(zhí)行圖像處理的軟件進行改進.最近，Hagen等［89］提出了新的樣品臺傾轉(zhuǎn)方案，該方案可在低傾轉(zhuǎn)角附近對稱地分配電子劑量，這進一步減少了電子束對樣品的損壞，并可顯著改善所得斷層圖的數(shù)據(jù)質(zhì)量和分辨率.但是，對于子斷層圖平均，限制分辨率的主要因素仍然是圖像對齊.為了進一步提高分辨率的極限，需要提出對齊傾轉(zhuǎn)系列圖像的新方案，例如可引入滲透進入細胞的納米顆粒作為基準標記的物理方案，或研發(fā)可用于單個傾轉(zhuǎn)角度圖像降噪的軟件.隨著軟件和硬件的不斷進步，原位cryo-ET的使用范圍將更廣泛，并將在接近原位的條件下提供更完整的細胞整體圖像.