吳斌，馬立平，張眉，姜珊珊，郭霞，張思聰，王升吉

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所／山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.平度市職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，山東平度 266752；3.山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250100）

玉米粗縮病是玉米生產(chǎn)中的一類重要病害，1949年首次在意大利發(fā)現(xiàn)后［1］，相繼在亞洲、南美洲和歐洲的一些國家發(fā)生［2］。1954年，首次在我國新疆和甘肅地區(qū)發(fā)現(xiàn)，自此在我國各玉米產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生［3］。玉米粗縮病已報(bào)到的病原有4種，分別是水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）［4，5］、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）［6］、玉米粗縮病毒（Maize rough dwarf virus，MRDV）［7］和里奧夸爾托病毒（Mal de Rio Cuarto virus，MRCV）［8］，山東玉米產(chǎn)區(qū)粗縮病主要病原為RBSDV。

近年來，隨著氣候條件變化、耕作制度和種植品種的改變，玉米粗縮病在黃淮海玉米產(chǎn)區(qū)常年發(fā)生，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)，制約當(dāng)?shù)赜衩桩a(chǎn)業(yè)發(fā)展。除農(nóng)藥防治、加強(qiáng)田間管理和錯(cuò)期播種，選育和推廣種植抗病品種是防治該病害的重要措施。

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源的、21～25 nt的小分子非編碼RNA，是真核生物基因表達(dá)中的一類調(diào)控因子，通過降解mRNA、翻譯抑制或通過改變靶基因的染色體結(jié)構(gòu)和基因組DNA的甲基化程度，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)［9，10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)在抵御病毒入侵方面起著非常重要的作用。Wu等［11，12］發(fā)現(xiàn)水稻條紋病毒侵染水稻后，miR168與miR528分別調(diào)控水稻體內(nèi)AGO1和抗壞血酸氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而影響對(duì)水稻條紋病毒（RSV）的抗性水平。Wang等［13］發(fā)現(xiàn)水稻 Os-MADS23、OsMADS27a和OsMADS57對(duì)OsRDR1轉(zhuǎn)錄的抑制作用受miR444負(fù)調(diào)控，從而激活抗病毒RNA沉默途徑。nta-miR6019和nta-miR6020通過影響NB-LRR類抗病基因受體的表達(dá)來調(diào)控對(duì)煙草花葉病毒（TMV）的抗性［14］。目前有關(guān)玉米粗縮病抗性相關(guān)miRNA研究未見報(bào)道。

本研究通過對(duì)RBSDV侵染不同抗性玉米品種的葉片和莖稈組織樣品進(jìn)行miRNA高通量測序，鑒定不同品種中差異表達(dá)的miRNAs，并進(jìn)行靶基因預(yù)測及功能富集分析，旨在篩選出玉米抗RBSDV相關(guān)miRNA，進(jìn)而為探明玉米抗粗縮病分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RBSDV毒源，采自山東省濟(jì)寧市魚臺(tái)縣玉米植株，保存于小麥葉片上；傳毒介體灰飛虱，飼養(yǎng)于健康的小麥苗上；玉米材料為耐病品種農(nóng)大108和感病品種鄭單958。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工接種 RBSDV 參照張愛紅等［15］的方法對(duì)不同抗性玉米品種進(jìn)行RBSDV人工接種。

1.2.2 miRNA測序 待鄭單958發(fā)病后，采集兩個(gè)品種接種病毒和未接種病毒處理的同時(shí)期同部位的植株葉片和莖稈組織（表1），編號(hào)后液氮速凍，干冰保存條件下送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行miRNA的文庫構(gòu)建和高通量測序。

表1 測序樣品信息

1.2.3 miRNA統(tǒng)計(jì) 原始測序數(shù)據(jù)首先去除3′接頭序列和堿基長度小于18 nt的序列，如果序列中有80%A或C或G或T，3N（不一定是連續(xù)的），只有 A、C沒有 G、T，或只有 G、T沒有 A、C，或者是連續(xù)的核苷酸二聚體、三聚體，這些序列均被過濾掉。同時(shí)，將測得的序列與mRNA、RFam（包含 rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等）以及 Repbase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)過濾，得到有效序列，去除重復(fù)序列后得到單一原始序列和單一有效序列，統(tǒng)計(jì)miRNA的長度分布和堿基偏好性。

1.2.4 miRNA注釋及預(yù)測 將測序得到的miRNA序列與miRBase中的玉米及其近緣物種成熟miRNA和miRNA前體序列進(jìn)行比對(duì)，整合有效序列的基因組比對(duì)結(jié)果。對(duì)于未注釋到任何信息的序列，運(yùn)用mireap預(yù)測新的miRNA。

1.2.5 miRNA差異表達(dá)分析 對(duì)各樣品中miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并對(duì)兩品種相同組織在接種病毒和未接種病毒處理間進(jìn)行比對(duì)，按照表達(dá)量倍數(shù)差異｜log2（fold change）｜＞2、P-value＜0.05篩選差異表達(dá)miRNAs。

1.2.6 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測及富集分析借助Target Finder對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，同時(shí)通過與Genome、KEGG pathway、Gene Ontology、KOG等生物信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)8個(gè)玉米miRNA文庫中測序所得的原始序列、過濾后長度大于18 nt的序列、去除重復(fù)后的miRNA序列數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表2。

表2 miRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) （個(gè)）

2.2 miRNA的長度分布及堿基偏好性

8個(gè)樣品中去重前后的序列長度分布情況見圖1，其豐度主要集中于18～25 nt之間，在24 nt的序列豐度最大。

圖1 miRNA序列的長度分布

miRNA中不同位置具有堿基偏好性，圖2為不同長度的miRNA 5′端首位堿基的出現(xiàn)頻率。結(jié)果表明，長度18～22 nt和25 nt的miRNA 5′端堿基以U居多，長度23 nt和24 nt的miRNA 5′端堿基以A居多。

圖2 miRNA首位堿基偏好性

2.3 miRNA注釋與新miRNA預(yù)測

將測序得到的miRNA序列與miRBase中的玉米及近緣物種基因組進(jìn)行比對(duì)，共獲得150個(gè)已知miRNA前體序列、174個(gè)單一miRNA序列和474個(gè)新miRNA序列（表3）。已知miRNA分屬28個(gè) miRNA家族，其中 miR166、miR169、miR171數(shù)目最多，均含有14個(gè)成員，其次是miR156，含有12個(gè)成員。

表3 miRNA注釋與新預(yù)測miRNA統(tǒng)計(jì)

2.4 miRNA差異表達(dá)分析

對(duì)各樣品中miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并用TPM算法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，分別對(duì)兩品種相同組織在接種病毒和未接種病毒處理間進(jìn)行比對(duì)，分析miRNA的表達(dá)差異性（表4）。結(jié)果表明，兩品種間莖稈組織中表達(dá)趨勢相反的miRNA有10個(gè)，葉片組織中表達(dá)趨勢相反的miRNA有17個(gè)（表5、表6）。

表4 差異表達(dá)miRNA數(shù)目統(tǒng)計(jì)

表5 品種間莖稈組織中差異表達(dá)miRNA

2.5 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測及分析

對(duì)差異表達(dá)的miRNA借助Target Finder進(jìn)行靶基因預(yù)測，結(jié)果表明，樣品中所有差異表達(dá)的miRNA共預(yù)測到1 870個(gè)靶基因，存在1 870個(gè)靶基因結(jié)合位點(diǎn)。

靶基因GO富集分析（圖3）表明，差異表達(dá)miRNA靶基因的生物過程主要集中在生物轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制等；細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞核內(nèi)過程、質(zhì)膜運(yùn)輸、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能主要涉及DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白結(jié)合等。

表6 品種間葉片組織中差異表達(dá)miRNA

圖3 差異表達(dá)miRNA的靶序列GO富集分析

靶基因KEGG通路分析（圖4）表明，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氧化磷酸化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、維生素B6代謝、吞噬體等通路。

3 討論與結(jié)論

miRNA具有高度保守性和特定的時(shí)空表達(dá)特性，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、器官發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆生理、病原物互作等重要過程中具有重要的功能。植物病毒的侵染可誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生大量的miRNA，通過上調(diào)或者下調(diào)等模式，抑制防衛(wèi)反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子或促進(jìn)防衛(wèi)反應(yīng)中的正調(diào)控因子，進(jìn)而行使功能，達(dá)到提高抗性的目的［16］。

種植抗病品種是防治玉米粗縮病的重要措施。因此，發(fā)掘玉米粗縮病抗性相關(guān)基因、miRNA或ta-siRNA等，分析其功能進(jìn)而探究抗病機(jī)制，可為抗病品種的遺傳改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，對(duì)確保玉米安全生產(chǎn)具有重要意義。本研究對(duì)感染RBSDV不同抗性玉米品種進(jìn)行了miRNA高通量測序，篩選出與抗性相關(guān)的miRNA，葉片組織中共獲得表達(dá)趨勢相反的miRNA 17個(gè)，莖稈組織中10個(gè)；靶基因GO富集分析和KEGG通路分析表明，差異表達(dá)的miRNA多與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白代謝等相關(guān)，分析可能在玉米抗粗縮病中起到調(diào)控作用。

圖4 差異表達(dá)miRNA的靶序列KEGG富集分析

miR156存在于多種植物中，參與植物的生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及生物脅迫等多種生物過程，是植物生長發(fā)育中重要的調(diào)控miRNA［17］。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米中誘導(dǎo)miR156表達(dá)量升高后，玉米的分蘗增加、植株矮化［18］；在水稻中，miR156通過調(diào)控12個(gè)靶序列影響對(duì)水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）的抗性［19］。miR171、miR166及其靶序列參與生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、脅迫相關(guān)蛋白等的調(diào)控，在玉米生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)等生物過程中發(fā)揮重要的作用［20-22］。miR169家族是各種非生物脅迫和發(fā)育途徑的普遍調(diào)節(jié)因子，參與作物的多種抗逆［23］。下一步，將以這些miRNA為研究對(duì)象，明確與玉米粗縮病抗性分化密切相關(guān)的miRNA及其靶基因，分析兩者間的調(diào)控模式，以期闡明該調(diào)控模式的作用機(jī)制。