劉瑞云 王欣 劉紅 于新娟 李慶海 張明泳青島大學(xué)附屬萊西市人民醫(yī)院呼吸與危重癥科6660;青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院東院呼吸與危重癥科6607

柴油機(jī)問世以來(lái),憑借其良好的動(dòng)力性、經(jīng)濟(jì)性和耐久性等優(yōu)點(diǎn)在各種動(dòng)力裝置上得到廣泛的應(yīng)用,柴油機(jī)尾氣 (diesel exhaust emissions,DEE)日益成為生活和生產(chǎn)環(huán)境中普遍存在的重要污染源之一[1]。長(zhǎng)期暴露于DEE 會(huì)導(dǎo)致呼吸、循環(huán)、神經(jīng)、生殖等多系統(tǒng)疾病,甚至誘發(fā)腫瘤(1989年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將DEE定義為2A 類致癌物)[2]。呼吸系統(tǒng)作為DEE的主要靶器官,會(huì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加,上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凋亡、膠原沉積和杯狀細(xì)胞增生,從而引發(fā)COPD、哮喘,甚至肺癌等[3-4]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明表觀遺傳調(diào)控是環(huán)境與人類各種疾病發(fā)展之間的關(guān)鍵連接,微小RNA(micro RNA,miRNA)與DEE暴露對(duì)健康的危害有關(guān)[5]。以往研究發(fā)現(xiàn),miR-155與哮喘、肺纖維化、肺損傷等密切相關(guān)[6-8]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)參與多種細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)途徑,下調(diào)miR-155 能夠通過SIRT1減輕急性肺損傷[4],可見SIRT1是一種潛在的氣道炎癥保護(hù)蛋白[4]。然而,目前還沒有關(guān)于DEE暴露條件下與miR-155之間關(guān)系的報(bào)道。本研究旨在探討長(zhǎng)期吸入DEE 對(duì)氣道炎癥和氧化應(yīng)激的影響,以及SIRT1和miR-155的相互作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 Sprague-Dawley雄性大鼠 (8周齡)從SIPPR/BK 實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物有限公司 (中國(guó)上海)購(gòu)買,隨機(jī)分為2 組 (每組15 只)。將DEE組大鼠放置在環(huán)境條件受控 [溫度 (23±2)℃,濕度 (50±10)%)的DEE 暴露系統(tǒng)中[CO、NO2和SO2濃度分別為 (15.32±1.91)、(3.28±0.35)和(1.32±0.15)ppm]。每天暴露5 h,每周5 d,連續(xù)12周。對(duì)照組大鼠暴露于用高效微?？諝膺^濾器和炭過濾器凈化的空氣中12周。研究方案通過青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)(2018臨審字第046號(hào))。

1.2 方法

1.2.1 尿收集和分析 根據(jù)Fitchett等[9]的方法收集尿液,儲(chǔ)存于1.5 ml微管中。采用商品化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒測(cè)定尿中8-羥基-2-脫氧鳥苷 (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHd G)和丙 二 醛 (malondialdehyde, MDA ) 含 量(8-OHd G檢驗(yàn)試劑盒,日本福井老齡控制研究所;MDA 試劑盒,南京建成生物工程研究所)。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定尿中2-羥基菲(2-hydroxyphenanthrene,2-OHPh)和9-OHPh水平[10]。

1.2.2 血清細(xì)胞因子測(cè)定 收集尿液后,用10%水合氯醛麻醉大鼠。用真空采血管采集外周血,以2 000×g 離心10 min 后,收集血清,用ELISA試劑盒測(cè)定IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)。IL-8、IL-6 和TNF-α試劑盒購(gòu)自Bender Medsystems (Burlingame,CA,USA)。

1.2.3 支 氣 管 肺 泡 灌 洗 液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)分析 采血后打開胸腔,結(jié)扎主支氣管右肺。用2.5 ml PBS 插管左肺灌洗3次,收集BALF。然后以300×g 離心10 min,分別收集BALF 細(xì)胞顆粒和上清液。然后將細(xì)胞重新懸浮于PBS 中,用血細(xì)胞儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。用Wright(美國(guó)密蘇里州圣路易斯西格瑪化學(xué)公司)對(duì)BALF 中的中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色,并用200個(gè)細(xì)胞/玻片計(jì)數(shù)。BALF 上清液在-80 ℃下保存,采用ELISA 試 劑 盒 測(cè) 定 上 清 液IL-8、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4 肺組織的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取大鼠右肺,上肺置于液氮中待用,下肺置于10%中性緩沖甲醛固定。固定24 h后,取出右下肺脫水、石蠟包埋,切片3 μm,蘇木精、伊紅、Masson三色染色,并進(jìn)行SIRT1免疫組織化學(xué)染色。切片脫蠟,用3%過氧化氫處理10 min。用檸檬酸鹽溶液提取抗原45 min。用5%牛血清白蛋白(Sigma Chemical Co.)阻 斷2 h 后,用SIRT1 抗體(clone 10E4,Sigma Chemical Co.)孵育切片4 ℃過夜,然后在37 ℃下與HRP 標(biāo)記的IgG(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)孵育1 h。在PBS中洗滌3次后,以二氨基聯(lián)苯胺為底物通過顯色反應(yīng)測(cè)定信號(hào)。右上肺組織低溫勻漿進(jìn)行核酸和蛋白檢測(cè)。

1.2.5 熒 光 定 量PCR 使 用TRIzol 試 劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取肺組織勻漿總RNA。檢測(cè)其純度后采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,USA) 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 然 后 使 用 SYBR?Premix-Ex-TaqTM(Takara,TX,USA)和ABI7300 系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR。PCR 體系的總體積為30μl,每個(gè)樣品含有300 ng c DNA。擴(kuò)增程序是在95 ℃下初始變性10 min,然后進(jìn)行45 個(gè)循環(huán) (95 ℃10 s,60 ℃30 s,85 ℃20 s)。U6 為miR-155 的 內(nèi) 參,將 所有熒光數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相對(duì)定量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-155 正 向 引 物:5'-CGGGCTCACAGTGAACCGG-3',miR-155 反向引物:5'-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3';U6 正 向 引 物:5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3',U6 反向引物:5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 肺組織勻漿,加入蛋白裂解液并分離總蛋白。取50 g總蛋白加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠中,100 V 電泳2 h。然后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后,TBST 洗 膜3 次,每 次10 min?？筍IRT1 抗 體(Abacam,ab110304,MA,USA)在4 ℃下孵育過夜。TBST 洗膜后,在室溫下將膜用HRP 標(biāo)記二抗(濃度1∶3 000)孵育1 h。TBST 洗膜3次,每次10 min。顯色成像后采用Image J分析各蛋白灰度值。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 在293T 細(xì)胞中采用雙熒光素酶基因報(bào)告法驗(yàn)證miR-155與SIRT1的靶向結(jié)合關(guān)系。具體步驟:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至24孔板上,常規(guī)培養(yǎng)達(dá)75%融合度時(shí),將細(xì)胞分為miR-NC 組、miR-155 組、miR-NC+si-SIRT1 組 和 miR-155 + si-SIRT1 組, 參 照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。48 h后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書,使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng) (Promega,Madison,WI,USA),檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性,并根據(jù)海腎熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。

1.2.8 RNA 免 疫 沉 淀 為 確 定SIRT1 與miR-155的關(guān)系,采用Magna-RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)試劑盒 (Millipore,Bedford,MA,USA)進(jìn)行RIP檢測(cè)。收獲80%匯合的293T 細(xì)胞并在RIP裂解緩沖液中裂解。 用含有抗 Ago2 抗體(Millipore)或IgG (Millipore)磁珠的RIP 緩沖液(100 ml)共免疫細(xì)胞株。用蛋白酶K 消化標(biāo)本,分離免疫沉淀RNA。通過RT-qPCR 分析共沉淀RNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 軟件 (version 23.0,Chicago,IL,USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s 表示,采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組大鼠尿液中2-OHPh、9-OHPh、MDA和8-OHd G水平 DEE 組大鼠尿液中2-OHPh 和9-OHPh 水平明顯高于對(duì)照組 (t 值分別為24.193、24.675,P 值均＜0.001),證 實(shí)造模成功。DEE 組大鼠尿液中MDA 和8-OHdG 水平高于對(duì)照組 (t 值分別為10.788、6.335,P 值均＜0.001),表明DEE暴露誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。見表1。

2.2 2 組大鼠血清和BALF 中促炎細(xì)胞因子水平 與對(duì)照組相比,DEE 組大鼠血清中IL-8、IL-6和TNF-α水平顯著升高 (t 值分別為14.864、17.558、11.883,P 值均＜0.001);同時(shí),DEE組大鼠BALF中IL-8、IL-6和TNF-α水平也明顯升高(t 值 分 別 為13.510、19.573、16.859,P 值均＜0.001),提示DEE暴露誘發(fā)炎癥。見表2。

2.3 2組大鼠BALF 中炎癥細(xì)胞的比較 除巨噬細(xì)胞外,DEE 組大鼠BALF 中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組 (t 值 分 別 為11.201、35.781、 -57.632、21.800,P 值均＜0.001),提示長(zhǎng)期吸入DEE 可導(dǎo)致氣道炎癥加重。見表3。

表1 2組大鼠尿液中2-OHPh、9-OHPh、MDA 和8-OHd G 水平 (μg/g肌酐,±s)

表1 2組大鼠尿液中2-OHPh、9-OHPh、MDA 和8-OHd G 水平 (μg/g肌酐,±s)

注:2-OHPh為2-羥基菲;9-OHPh為9-羥基菲;MDA 為丙二醛;8-OHdG 為8-羥基-2-脫氧鳥苷

組別 鼠數(shù) 2-OHPh 9-OHPh MDA 8-OHdG對(duì)照組 15 0.46±0.09 0.31±0.03 2.95±0.29 2.27±0.32 DEE組 15 1.83±0.20 1.16±0.13 4.56±0.50 3.20±0.47 t值 24.193 24.675 10.788 6.335 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 2組大鼠血清、BALF中IL-8、IL-6和TNF-α水平 (ng/L,±s)

表2 2組大鼠血清、BALF中IL-8、IL-6和TNF-α水平 (ng/L,±s)

注:BALF為支氣管肺泡灌洗液;TNF-α為腫瘤壞死因子α

組別 鼠數(shù) 血清BALF IL-8 IL-6 TNF-α IL-8 IL-6 TNF-α對(duì)照組 15 1.50±0.24 2.08±0.15 1.10±0.16 1.65±0.14 2.11±0.14 1.42±0.15 DEE組 15 2.83±0.25 4.49±0.51 1.91±0.21 3.03±0.37 4.54±0.46 2.88±0.30 t值 14.864 17.558 11.883 13.510 19.573 16.859 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 2組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞的比較 (±s)

表3 2組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞的比較 (±s)

注:BALF為支氣管肺泡灌洗液

組別 鼠數(shù) 白細(xì)胞(×104/ml)中性粒細(xì)胞(×104/ml)嗜酸粒細(xì)胞(×104/ml)巨噬細(xì)胞(×104/ml)淋巴細(xì)胞(×104/ml)對(duì)照組 15 38.23±2.62 0.45±0.11 0.16±0.13 37.64±3.51 0.04±0.05 DEE組 15 52.35±4.12 5.27±0.51 7.13±0.45 39.10±5.2 0.93±0.15 t值 11.201 35.781 -57.632 9.010 21.800 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.367 ＜0.001

2.4 2組大鼠肺組織的病理改變 HE 和Masson三色染色法顯示,與對(duì)照組相比,DEE 組表現(xiàn)為明顯的氣道炎癥和重塑,如支氣管周圍結(jié)締組織炎性浸潤(rùn)、氣道壁增厚、小氣道損傷和病理重塑、杯狀細(xì)胞增生和明顯的膠原沉積 (圖1、2)。免疫組織化學(xué)顯示DEE暴露后肺組織中SIRT1的表達(dá)下降(圖3)。

圖1 2組大鼠肺組織炎性浸潤(rùn) A:對(duì)照組;B:柴油機(jī)尾氣組 HE ×100

2.5 2組大鼠肺組織中miR-155和SIRT1水平的比較 與對(duì)照組相比,DEE 組大鼠肺組織中miR-155水 平 升 高 (t =21.854,P ＜0.001),SIRT1水平降低(t=25.580,P ＜0.001)。見表4。2.6 miR-155 靶向SIRT1 從targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.targetscan.org/vert_72/)可知,人miR-155與SIRT1 的3'-UTR 有結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-155模擬物可下調(diào)SIRT1野生型質(zhì)粒組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,但對(duì)突變型SIRT1 的熒光素酶的活性影響不顯著。抗AGO2-RIP分析發(fā)現(xiàn),SIRT1 在miR-155 組中優(yōu)先富集。以上結(jié)果說(shuō)明miR-155和SIRT1存在靶向關(guān)系。見圖4。

圖2 2組大鼠肺組織膠原沉積 A:對(duì)照組;B:柴油機(jī)尾氣組 Masson ×100

圖3 2組大鼠肺組織中SIRT1 的表達(dá) A:對(duì)照組;B:柴油機(jī)尾氣組 免疫組織化學(xué)染色 ×100

表4 2組大鼠肺組織中miR-155、SIRT1表達(dá)水平 (±s)

表4 2組大鼠肺組織中miR-155、SIRT1表達(dá)水平 (±s)

注:SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1

組別 鼠數(shù) miR-155 SIRT1對(duì)照組 15 1.04±0.13 0.99±0.09 DEE組 15 2.63±0.25 0.31±0.05 t值 21.854 25.580 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

本研究首次探討miR-155-SIRT1 通路在長(zhǎng)期DEE暴露大鼠氣道炎癥和氧化應(yīng)激中的作用。自1892年問世以來(lái),柴油機(jī)被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)力裝置中。而且在全球11個(gè)主要汽車市場(chǎng)中,近1/3的重型柴油車和一半以上的輕型柴油車排放超標(biāo)[1],DEE已成為最重要的空氣污染源之一。此外,職業(yè)性DEE 接觸非常普遍,發(fā)生在采礦、專業(yè)駕駛、建筑施工等使用柴油動(dòng)力車輛和工具的活動(dòng)中,研究DEE暴露對(duì)健康不良影響的潛在機(jī)制刻不容緩。

本研究首先通過對(duì)大鼠尿液生化指標(biāo)測(cè)定,評(píng)價(jià)慢性吸入DEE 對(duì)氧化應(yīng)激的影響。在尿液中的多環(huán)芳烴代謝物中,OHPh 是一種最特異于DEE暴露的內(nèi)照射生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn),DEE 暴露顯著增加了尿液中多環(huán)芳烴2-OHPh 和9-OHPh的代謝產(chǎn)物水平,與以往的研究結(jié)果[11]一致,也證實(shí)造模成功。MDA 和8-OHdG 分別是氧化脂質(zhì)和DNA 損傷最敏感的標(biāo)志物。本研究顯示DEE組大鼠尿液中MDA 和8-OHdG 水平升高,提示DEE暴露誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,與Miglani等[12]研究結(jié)果一致。

與對(duì)照組相比,DEE 組大鼠血清和BALF 中炎癥相關(guān)蛋白IL-8、IL-6、TNF-α 的表達(dá)升高,BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著增加,肺組織中氣道炎癥和重塑明顯。重塑被認(rèn)為是繼發(fā)于長(zhǎng)期炎癥,其特征是一些結(jié)構(gòu)改變,包括支氣管平滑肌增厚和上皮下纖維化,以及氣道壁增厚。這些結(jié)果表明,暴露于DEE會(huì)導(dǎo)致大鼠長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng),這與之前在中國(guó)職業(yè)隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)的DEE 引起的炎癥損害肺功能的結(jié)果[13]一致。

miRNA 是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞生物過程功能的非編碼RNA。近年來(lái)大量研究表明環(huán)境污染的致病機(jī)制與多種miRNA 表達(dá)水平改變有關(guān)[5]。Xiao等[14]發(fā)現(xiàn)在PM2.5暴露后人支氣管上皮細(xì)胞中miR-155表達(dá)上調(diào)促發(fā)細(xì)胞增殖、分化周期異常,介導(dǎo)呼吸系統(tǒng)損傷。在一項(xiàng)兒童哮喘與室內(nèi)污染關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)室內(nèi)空氣污染導(dǎo)致180例哮喘兒童血清miR-155水平明顯升高,且與室內(nèi)PM2.5水平密切相關(guān)[15]。DEE顆粒是PM2.5的重要組成成分。在本研究中DEE 暴露后大鼠肺組織miR-155表達(dá)增加,SIRT1 表達(dá)下降。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SIRT1是miR-155直接作用靶點(diǎn)。以往多個(gè)研究表明,miR-155 參與SIRT1通路調(diào)控,引發(fā)多種疾病器官損傷和炎癥調(diào)控。miR-155通過靶向SIRT1 調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,引起急性腎損傷,miR-155抑制劑對(duì)SIRT1的去抑制作用減弱了脂多糖誘導(dǎo)的腎細(xì)胞死亡[16]。在心肌缺血/再灌注損傷小鼠的心肌組織中miR-155 高表達(dá),靶向負(fù)調(diào)控SIRT1 使其表達(dá)水平下降,七氟醚可以降低miR-155的表達(dá)并增加SIRT1 的表達(dá),防止小鼠缺血/再灌注損傷[17]。在過敏性鼻炎患者的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中,miR-155通過抑制SIRT1和SOCS1信號(hào)通路促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增殖[18],而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在限制氣道變應(yīng)性炎癥和防止對(duì)環(huán)境變應(yīng)原的不適當(dāng)反應(yīng)中起重要作用。抑制miR-155 后增加其靶標(biāo)分子SOCS1、SIRT1 的表達(dá),進(jìn)而抑制STAT3和NF-κB途徑的活化,從而改善模型小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化炎癥和斑塊穩(wěn)定性[19]。結(jié)合前人研究及本研究結(jié)果,DEE 暴露后miR-155可能通過調(diào)控SIRT1表達(dá)介導(dǎo)肺部炎癥損傷。

圖4 miR-155靶向SIRT1 A:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-155和和SIRT1之間的潛在結(jié)合位點(diǎn);B:雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果;C:AGO2-RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜上所述,暴露于DEE 對(duì)人體健康,特別是呼吸系統(tǒng)的危害很大,闡明潛在機(jī)制,確定關(guān)鍵的靶點(diǎn),對(duì)于開發(fā)新的有效治療策略至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明,長(zhǎng)期暴露于DEE 可引起肺部炎癥和氧化應(yīng)激增強(qiáng),部分可能是通過miR-155 對(duì)SIRT1表達(dá)的抑制,具體病理生理機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突