白海濤，王 偉，2，3，魏希杰，2，3，韓日疇，徐成體，2，3*

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2. 青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016； 3. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；4. 廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室， 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣州 510260)

青海省地處青藏高原腹地，是我國五大牧區(qū)之一。青海省有可利用草地面積3 161.03萬hm2，其中可利用高寒草甸草地面積2 141.25萬hm2，占全省可利用草地面積的68%。全省草原毛蟲分布面積106.19萬hm2，蟲口密度≥30頭/m2，為害面積70.17萬hm2，是青海省草地的重要害蟲(何德孝，2003)。

草原毛蟲中文學(xué)名為黃斑草毒蛾Gynaephoraalpherakii，屬鱗翅目Lepidoptera毒蛾科Lymantriidae草原毛蟲屬Gynaephora，屬青海省特有草原害蟲，我國草原毛蟲屬的8個(gè)種均分布于青藏高原(張棋麟，2013)，為害青海省高寒草甸類草地的主要種是青海草原毛蟲Gynaephoraqinghaiensis(青海草原毛蟲幼蟲的足、前胸和肛上板均為黃色)。高寒草甸類草地中豐富的莎草科、嵩草科及禾本科植物(張衛(wèi)國，2005)為草原毛蟲提供了涼爽、濕潤的生長及繁衍環(huán)境。

草原毛蟲一年發(fā)生一代，各齡期生長發(fā)育時(shí)間隨環(huán)境氣候的變化而變化。通常情況下，草原毛蟲1～3齡幼蟲生長發(fā)育期處于5月中旬至6月中旬，1齡幼蟲發(fā)育周期平均14 d，2齡幼蟲發(fā)育周期12 d，3齡幼蟲發(fā)育周期13 d；草原毛蟲4～5齡幼蟲生長發(fā)育期處于6月下旬至7月中旬，該期間氣溫偏低、雨水較大，毛蟲幼蟲的活動(dòng)受到一定制約，幼蟲生長緩慢，齡期較長，4齡幼蟲發(fā)育周期平均17 d，5齡幼蟲發(fā)育周期18 d；草原毛蟲6齡幼蟲生長發(fā)育期處于7月下旬至8月上旬，該期間氣候涼爽，牧草營養(yǎng)豐富，完成一個(gè)齡期僅需12 d(馬玉海，1994；張棋麟，2013)。

針對草原毛蟲的防治，現(xiàn)階段的防治方法主要是通過2%苦參堿水劑(余慧芩，2016)和0.5%蛇床子素水乳劑對草原毛蟲進(jìn)行防治，而生物防治草原毛蟲的研究未見報(bào)道。

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematodes，EPN)是近年來新型的生物防治手段，是一種安全有效的生物制劑。線蟲侵染期幼蟲可以通過口器、肛門、氣孔或直接刺破寄主壁進(jìn)入寄生昆蟲體內(nèi)，釋放共生菌，共生菌在血淋巴中迅速繁殖，使被寄生昆蟲患敗血病死亡(韓日疇，2007；范芳芳，2015)。這類線蟲具有能夠自主搜尋寄生并殺死害蟲，對人畜、環(huán)境安全，能夠以人工培養(yǎng)基低成本大量培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是國際上新型的高效生物殺蟲劑(Georgis，2006)。目前我國各地區(qū)應(yīng)用昆蟲病原線蟲防治鱗翅目害蟲的報(bào)道有很多，如桃透翅蛾Synanthedonexitiosa、葡萄根透翅蛾P(guān)aranthreneregalisButler、黃地老虎Agrotissegetum、斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)、腰果云翅斑螟等(Shapiro-Ilanetal.，2010；Williamsetal.，2011；張安邦，2015；王麗麗，2015；張中潤，2017)，但尚未見過在高寒草甸類草地利用昆蟲病原線蟲防治草原毛蟲的研究。為探究昆蟲病原線蟲對草原毛蟲的侵染效果，本研究通過篩選昆蟲病原線蟲品系，探究不同環(huán)境溫度下、不同劑量的昆蟲病原線蟲對草原毛蟲幼蟲的室內(nèi)致病力，以期為草原害蟲生物防治工作提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1昆蟲病原線蟲

SteinernemalongicaudumX-7，S.carpocapsaeAll，S.feltiaeSN，HeterorhabditisindicaLN2和H.bacteriophoraH06的感染幼蟲(Infective juveniles，IJs)由廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所昆蟲病原線蟲濰坊生產(chǎn)基地提供。

1.1.2草原毛蟲5齡幼蟲

采自青海省玉樹州稱多縣珍秦鄉(xiāng)(北緯33°24′38″，東經(jīng)97°18′17″，海拔4 261 m)。

1.1.3供試線蟲的制備

取兩藥匙昆蟲病原線蟲粉劑分別溶解至裝有400 mL無菌水的三角瓶中，搖勻，得到線蟲稀釋液。用微量取樣器汲取25 μL線蟲稀釋液滴至培養(yǎng)皿上，解剖鏡下計(jì)算存活線蟲濃度。

1.2 方法

1.2.1昆蟲病原線蟲的篩選

制備5種供試線蟲制劑，濃度設(shè)置為2 500 IJs/mL。

在培養(yǎng)皿(9 cm)中墊兩層中速濾紙，并放入10片7 cm牧草嫩葉，每皿放入5頭草原毛蟲幼蟲，分別向各培養(yǎng)皿中滴加1 mL 2 500 IJs/mL的各供試線蟲。每種線蟲侵染處理重復(fù)3次，設(shè)置無菌水對照。將培養(yǎng)皿置于20±2℃、RH 80%～85%，無光照培養(yǎng)箱中，每24 h補(bǔ)充更換飼料。處理24 h、48 h和72 h后觀察毛蟲幼蟲的死亡情況，記錄總蟲數(shù)及死蟲數(shù)。

1.2.2不同溫度下昆蟲病原線蟲對草原毛蟲幼蟲的致病力

制備供試線蟲制劑，線蟲濃度設(shè)置為2 500 IJs/mL，溫度梯度設(shè)為11℃，18℃，25℃、32℃。

每個(gè)培養(yǎng)皿(9 cm)底墊兩層中速濾紙，放入5頭5齡幼蟲和10片7 cm牧草嫩葉，滴加1 mL 2 500 IJs/mL供試線蟲。每種線蟲侵染處理重復(fù)3次，設(shè)置無菌水對照。將每個(gè)處理分別放置到不同溫度的人工氣候培養(yǎng)箱中(相對濕度為80%～85%、無光照)，每24 h補(bǔ)充更換飼料；每24 h觀察一次，連續(xù)觀察144 h，統(tǒng)計(jì)死蟲數(shù)目。

1.2.3不同劑量的昆蟲病原線蟲對草原毛蟲幼蟲的致病力

針對夏季高寒草甸草地氣候條件，測定低溫環(huán)境下(11℃)不同劑量線蟲對草原毛蟲的致病力的影響。供試線蟲4個(gè)梯度濃度液分別為2 000 IJs/mL、2 500 IJs/mL、3 000 IJs/mL、3 500 IJs/mL。

每個(gè)培養(yǎng)皿(9 cm)底墊兩層中速濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入5頭5齡幼蟲并放入10片7 cm牧草嫩葉，滴加1 mL相應(yīng)濃度的供試線蟲至培養(yǎng)皿中。每種線蟲侵染處理重復(fù)3次，設(shè)置無菌水對照。置于溫度11±2℃、RH 80%～85%、無光照的人工氣候培養(yǎng)箱中；每24 h觀察1次，連續(xù)觀察144 h，統(tǒng)計(jì)死蟲數(shù)目并按時(shí)補(bǔ)充更換飼料。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均在Excel 2003與SPSS 19 for Windows(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)統(tǒng)計(jì)分析軟件上完成，處理間經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換及方差分析統(tǒng)計(jì)差異顯著后，用Duncan氏多重比較方法進(jìn)行顯著性測定。

死亡率(%)=線蟲寄生致死蟲數(shù)÷處理總蟲數(shù)×100

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)÷(1-對照死亡率)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲的篩選

5種昆蟲病原線蟲處理草原毛蟲72 h后，SteinernemacarpocapsaeAll和SteinernemafeltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致死率(幼蟲死亡率分別為83.75%、100%)顯著高于S.longicaudumX-7、H.indicaLN2和H.bacteriophoraH06(F=23.300，df=5，12，P<0.05)(表1)。隨著處理時(shí)間的延長，H.indicaLN2和H.bacteriophoraH06線蟲對草原毛蟲的致死力沒有顯著地增長，72 h內(nèi)草原毛蟲死亡率均低于20%，而S.carpocapsaeAll、S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致死率則高達(dá)80%以上。

表1 5種昆蟲病原線蟲對草原毛蟲幼蟲的致死率Table 1 Mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by 5 entomopathogenic nematode species

2.2 不同溫度下S. carpocapsae All，S. feltiae SN線蟲對草原毛蟲幼蟲的致病力

2.2.1不同溫度下S.carpocapsaeAll線蟲對草原毛蟲幼蟲的致病力

不同溫度下S.carpocapsaeAll線蟲對草原毛蟲的致死率見表2。當(dāng)溫度為11℃，處理48～72 h草原毛蟲死亡率為0%；當(dāng)溫度為18℃、25℃和32℃，處理48 h毛蟲幼蟲死亡率分別為13.33%、86.67%、13.33%；處理后72 h草原毛蟲死亡率分別為86.67%、100%、66.67%。處理后72 h，25℃毛蟲死亡率顯著高于其他3個(gè)溫度下毛蟲的死亡率(F=32.486，df=3，8，P<0.05)，過高和過低的溫度均對S.carpocapsaeAll線蟲的侵染力有一定的影響，且隨著侵染時(shí)間的延長，毛蟲死亡率提高。

表2 在不同溫度下Steinernem carpocapsae All線蟲(2 500 IJS/mL)對草原毛蟲幼蟲的致死率Table 2 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema carpocapsae All at 2 500 IJS/mL at different temperatures

2.2.2不同溫度下S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲幼蟲的致病力

不同溫度下S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致死率見表3。隨著侵染時(shí)間的增長，毛蟲幼蟲的致死率逐漸增長。處理48 h后，11℃、18℃、25和32℃溫度下草原毛蟲死亡率分別為13.33%、20%、66.67%、13.33%；處理72 h后，11℃、18℃、25℃和32℃溫度下草原毛蟲死亡率分別為40%、60%、93.33%、46.67%。25℃時(shí)，S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致死率顯著高于其他3個(gè)溫度下的致死率(F=8.130，df=3，8，P<0.05)，且隨著侵染時(shí)間的延長，幼蟲死亡率提高。25℃相對于其他3個(gè)溫度更適宜S.feltiaeSN線蟲的侵染活動(dòng)。

表3 在不同溫度下Steinernema feltiae SN線蟲(2500IJS/mL濃度)對草原毛蟲幼蟲的致死力Table 3 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema feltiae SN at 2 500 IJS/mL at different temperatures

2.3 不同劑量S. carpocapsae All和S. feltiae SN對草原毛蟲幼蟲的致死力

2.3.1不同劑量S.carpocapsaeAll線蟲對草原毛蟲幼蟲的致死力

在11℃下處理后120 h，2 500 IJs/mL、3 000 IJs/mL和3 500 IJs/mL劑量下S.carpocapsaeAll線蟲對草原毛蟲的致死率無顯著性差異，草原毛蟲死亡率分別為40%、60%、66.67%，顯著高于2 000 IJs/mL劑量下草原毛蟲的死亡率(F=8.333，df=3，8，P<0.05)(圖1)。高于2 500 IJs/mL的線蟲劑量對草原毛蟲的致死率差異不顯著。

圖1 11℃時(shí)不同濃度Steinernema carpocapsae All線蟲對草原毛蟲幼蟲的致死率Fig.1 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema carpocapsae All at different concentrations at 11℃ 注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下圖同。Note：The same lines with different letters indicate significant differences between different treatments(P<0.05).Same below.

2.3.2不同劑量S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲幼蟲的致死率

在11℃下處理后120 h，3 500 IJs/mL劑量下S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致死率為93.33%，顯著高于2 000 IJs/mL、2 500 IJs/mL劑量下毛蟲的死亡率(F=8.333，df=3，8，P<0.05)，與3 000 IJs/mL劑量下S.feltiaeSN線蟲的致病力無明顯差異。隨著線蟲劑量的增加，S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致死率顯著提高。

圖2 11℃時(shí)不同濃度Steinernema feltiae SN線蟲對草原毛蟲幼蟲的致死率Fig.2 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema feltiae SN at different concentrations at 11℃

3 討論與結(jié)論

我國成功應(yīng)用斯氏線蟲防治鱗翅目害蟲的例子有很多，如趙奎軍(1996)應(yīng)用斯氏線蟲防治8種鱗翅目、鞘翅目害蟲的研究中，S.feltiaeBeijing品系線蟲對鱗翅目害蟲的侵染效果均在70%以上，其中對向日葵螟Homoeosomanebulellum和小菜蛾P(guān)lutellaxylostell的侵染效果均達(dá)到94.7%～100%。張安邦(2015)等利用昆蟲病原線蟲對黃地老虎Agrotissegetum致病力的研究中，表明其對黃地老虎有著較高的致病力，防治效果高達(dá)96.67%。姚紅燕(2015)等在防治斜紋夜蛾幼蟲的研究中，利用斯氏線蟲對其進(jìn)行侵染測定，在一定條件下，48 h和72 h線蟲對斜紋夜蛾幼蟲的致病力分別達(dá)到了86.67%和93.33%。2018年報(bào)道過S.carpocapsaeAll線蟲對6齡舞毒蛾Lymantriddispar幼蟲侵染效果的研究(滑莎，2018)，室內(nèi)侵染效果達(dá)到100%。

本研究結(jié)果表明，溫度在25℃時(shí)S.carpocapsaeAll、S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲幼蟲均有較高的致死率，且隨著線蟲劑量的增加，線蟲對草原毛蟲幼蟲的致死率也隨之提高，處理72 h草原毛蟲死亡率均達(dá)90%以上；溫度在11℃時(shí)S.feltiaeSN線蟲對草原毛蟲的致病力強(qiáng)于S.carpocapsaeAll線蟲，處理144 h后草原毛蟲的死亡率高達(dá)100%，而S.carpocapsaeAll線蟲處理的草原毛蟲死亡率僅為60%，且隨著線蟲濃度的增加，草原毛蟲死亡率無顯著提升。本論文結(jié)果可為利用S.feltiaeSN線蟲于低溫的草原環(huán)境下防控草原毛蟲幼蟲提供參考和依據(jù)。