來涌凱，周宜潔，陳中蘇直，何妹英，屈紅霞，王永飛*

外源EGCG對采后龍眼果肉品質(zhì)的影響

來涌凱1，周宜潔2，陳中蘇直2，何妹英2，屈紅霞2，王永飛1*

(1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.中國科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510630)

為探究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對采后龍眼的保鮮效果，用濃度為1 mmol/L的EGCG溶液浸泡采后龍眼果實5 min，于25 ℃條件下貯藏，分別在貯藏的第2、4、6、8天取樣測定果肉自溶指數(shù)、抗氧化物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等。結(jié)果表明：外源EGCG處理采后龍眼果實的第6和第8天時，果肉自溶指數(shù)分別較對照下降22.56%、11.70%；第8天時果肉可溶性固形物和可滴定酸的含量分別是對照的1.16、1.17倍；EGCG處理顯著提高脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶活性，且上調(diào)和等酶基因的相對表達。

龍眼；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；果肉品質(zhì)；抗氧化基因表達

采后龍眼代謝旺盛，果皮褐變快，果肉易腐爛，不耐貯運。果肉“自溶”是導(dǎo)致龍眼果實品質(zhì)劣變的主要原因。JIANG等[1]研究認為，龍眼果肉自溶與果肉抗氧化系統(tǒng)能力下降、能量虧缺等因素有關(guān)。現(xiàn)階段采用化學(xué)保鮮劑(如SO2熏蒸)處理和冷鏈物流保鮮等雖大大減輕龍眼果實品質(zhì)劣變和采后損耗，但仍存在化學(xué)殘留和冷鏈物流不普及等問題[2]。

借鑒表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在減輕蘋果油膩化、延緩魚類感官品質(zhì)下降等方面已得到研究應(yīng)用[3–4]，筆者以1 mmol/L的EGCG作為外源處理劑，浸泡采后龍眼，于25 ℃下貯藏，以清水浸泡作為對照，分別測定對照組和EGCG處理組龍眼果肉第2、4、6、8天的營養(yǎng)品質(zhì)、抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達，以期為龍眼貯藏、物流保鮮拓展新途徑。

1　材料與方法

1.1　材料

‘石硤’龍眼，采自廣州市從化地區(qū)果園。

EGCG，純度98%，南京道斯夫生物科技有限公司出品。

1.2　方法

選取顏色、大小均一的采后2 h內(nèi)龍眼果實，用0.1%施保克溶液浸泡3 min，晾干后將龍眼果實隨機分成2組，每組300個果實。1組果實用1 mmol/L的EGCG溶液浸泡5 min(處理)，另一組果實在清水中浸泡5 min(對照)。晾干后分別用厚0.03 mm的聚乙烯袋包裝，每袋30個果實，在25 ℃下貯藏。分別在當天和貯藏后第2、4、6、8 天取樣，測定龍眼果肉自溶指數(shù)[5]，丙二醛含量[6]，可溶性固形物(TSS)[7]，可滴定酸(TA)含量[7]，內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)(AsA、GSH)含量[8–9]，抗氧化酶(CAT、POD)活性[10–13]。

從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(NCBI Sequence Read Archive，SRA315202)中獲得、、、4種酶基因的CDS序列信息，利用Primer Premier 5.0 (Premier，Canada)設(shè)計引物(表1)，委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　熒光定量PCR引物序列

利用北京天根公司的植物RNA提取試劑盒，提取龍眼果肉RNA，用Prime Script RT試劑盒(TAKARA，Japan)反轉(zhuǎn)錄cDNA后作為模板。熒光定量PCR所用試劑盒為SYBR Green Master Mix(TAKARA，Japan)，利用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.3　數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；采單因素方差分析法(ANOVA)進行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　EGCG對采后龍眼果肉品質(zhì)的影響

外源EGCG處理龍眼的果肉品質(zhì)的測定結(jié)果列于表2。由表2可知，貯藏后第2天，EGCG處理組龍眼果肉自溶指數(shù)顯著低于對照組；至貯藏第4、6和8天時，龍眼果肉自溶指數(shù)顯著低于對照組，到第8天時，對照組龍眼果肉自溶指數(shù)達到2.22。

表2　EGCG處理的采后龍眼的果肉品質(zhì)

表2(續(xù))

同一指標同一時間處理組與對照組字母不同，示二者差異顯著(<0.05)。

EGCG處理組龍眼果肉的MDA含量均低于對照組，其中第4天和第6天時差異顯著；第8天對照組龍眼果肉中MDA含量高達17.6 nmol/g，是EGCG處理組的1.81倍，二者差異顯著。這些結(jié)果表明，EGCG處理可以降低龍眼果肉MDA累積，并有效降低龍眼果肉自溶指數(shù)。

龍眼果肉可溶性固形物含量隨貯藏時間的延長總體呈下降趨勢，EGCG可以延緩龍眼果肉可溶性固形物含量下降，在第4天時差異顯著，第6、8天差異極顯著。說明EGCG處理在一定程度上維持了可溶性固形物含量和較高的果實品質(zhì)。此外，隨著貯藏時間的延長，可滴定酸含量逐漸升高。EGCG處理極顯著增加龍眼果肉可滴定酸含量，表明EGCG處理有利于維持果肉中的有機酸等營養(yǎng)成分。

此外，隨著貯藏時間的延長，龍眼果肉中AsA含量呈下降趨勢，在第2、4天時，經(jīng)EGCG處理的龍眼果肉中AsA含量均顯著高于對照，第6、8天時顯著高于對照。說明EGCG處理可以維持龍眼果肉AsA含量，保持龍眼果肉營養(yǎng)品質(zhì)。

2.2　EGCG對龍眼果肉抗氧化能力的影響

由表3可知，采后龍眼果肉GSH含量前4天呈上升趨勢，之后呈下降趨勢，可能是龍眼采收后響應(yīng)衰老等逆境脅迫產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致GSH增多，而貯藏后期龍眼果肉中GSH被氧化分解，含量下降。經(jīng)EGCG處理的龍眼果肉中GSH含量均顯著高于對照，表明EGCG維持了果肉中GSH含量，提高細胞中活性氧清除能力。

表3　EGCG處理的龍眼果肉抗氧化能力

貯藏時間/dGR活性/(U·g–1)GSH含量/(mg·g–1) 對照組處理組對照組處理組 033.33±0.2433.33±0.240.34±0.000.34±0.00 2(33.70±0.35)a(36.11±0.11)b(0.37±0.00)a(0.39±0.00)b 4(35.45±0.16)a(34.19±0.15)b(0.37±0.00)a(0.50±0.00)b 6(24.45±0.39)a(27.22±0.19)b(0.33±0.01)a(0.46±0.01)b 8(17.49±0.43)a(21.46±0.41)b(0.32±0.00)a(0.41±0.00)b

同一指標同一時間處理組與對照組字母不同，示二者差異顯著(<0.05)。

采后龍眼果肉CAT活性不斷下降，到第8天時已經(jīng)降低至原有活性的20.2%。EGCG顯著延緩CAT活性下降，并且在整個貯藏期間其活性均顯著高于對照組。在貯藏第2、4和6天時，CAT活性分別比對照組提高了40.46%、120.31%和92.77%，第8天時，EGCG處理組CAT活性是對照組的1.88倍。采后龍眼果肉POD活性呈不斷上升的趨勢，EGCG處理組與對照組前4天差異不顯著，后4天EGCG處理組的POD酶活性顯著低于對照。表明EGCG有利于保持較高水平的CAT活性，并在貯藏后期抑制POD活性，從而保持果實組織較強的抗氧化活性。

采后龍眼果肉中DHAR活性總體呈下降趨勢，EGCG顯著延緩DHAR活性的下降。此外，龍眼果肉中GR活性前4天呈上升趨勢，之后呈下降趨勢，與GSH累積趨勢相似，但峰值出現(xiàn)的時間點不相同，可能與其他途徑生成的GSH增加相關(guān)。在貯藏初期，采后龍眼氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧可能作為信號分子激發(fā)并提高GR活性，進而合成GSH以抵御攻擊，第4至8天由于衰老速度加快，GR等抗氧化酶自身被氧化損傷，從而活性急劇降低。此外，EGCG處理后的龍眼果肉中GR活性在第2天出現(xiàn)峰值，對照組則在第4天出現(xiàn)峰值，可見EGCG能使GR提早響應(yīng)活性氧信號，并在貯藏后期顯著延緩GR活性下降。

2.3　EGCG對龍眼果肉DlDHAR、DlGR、DlCAT和DlPOD基因表達的影響

RT–qPCR結(jié)果表明，對照組貯藏期間果肉相對表達量前2 d呈上升趨勢，至第4天呈下降趨勢，至第8天又呈上升趨勢，和總體變化不大，則顯著表達上調(diào)，到第8天時達到采收時的5.38倍。EGCG顯著上調(diào)、和的表達。EGCG在前4天上調(diào)的表達，之后則顯著下調(diào)的表達。結(jié)果表明，外源EGCG處理對龍眼果肉中4種酶基因表達有顯著影響，在基因表達水平方面對提高龍眼果肉組織活性氧清除能力有重要作用(圖1)。

圖1　EGCG處理后果肉DlDHAR、DlGR、DlCAT和DlPOD基因表達

3　討論

采后龍眼隨著貯藏時間的延長，果肉開始變軟、流汁，甚至腐爛、自溶，因而喪失食用價值。谷李桃等[14]認為，龍眼果肉自溶與衰老過程中產(chǎn)生的活性氧(H2O2、·OH、O2–·等)密切相關(guān)，氧化損傷加劇細胞衰老，促進果肉自溶的發(fā)生。隨著采后果實衰老程度持續(xù)加深，活性氧不斷累積，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，膜脂過氧化導(dǎo)致MDA累積，進而加速果實品質(zhì)劣變。已有的研究[15–17]表明，EGCG能有效抑制脂肪氧化酶(LOX)、環(huán)氧酶(PGs)等與產(chǎn)生活性氧相關(guān)的酶類的活性，這些酶類與龍眼果實衰老有直接關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，用1 mol/L的EGCG處理采后龍眼，有效降低了MDA含量的累積速率，減輕了果肉自溶程度，起到了較好的保鮮作用。

外源EGCG處理后，龍眼果肉中內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)(AsA、GSH)含量維持在較高水平，同時上調(diào)和的表達，顯著影響DHAR、GR的活性，保持了AsA和GSH的再生能力。以上分析說明外源EGCG處理影響AsA–GSH循環(huán)系統(tǒng)，增加抗氧化物質(zhì)的含量，通過參與非酶促抗氧化系統(tǒng)，提高龍眼果肉中活性氧的清除能力。

植物組織中活性氧清除的另一條途徑是酶促抗氧化系統(tǒng)，CAT和POD在其中發(fā)揮重要作用。CAT是一種H2O2清除酶，其活性大小可以反映組織活性氧清除能力的強弱。本研究結(jié)果表明，EGCG總體上調(diào)的表達，龍眼果肉CAT活性也顯著高于對照，說明EGCG影響CAT基因表達，有效延緩CAT活性下降，從而保持了較高水平的H2O2清除能力。陳子健等[18]研究發(fā)現(xiàn)，龍眼采后果肉POD酶活性發(fā)生明顯變化，與自溶的發(fā)生密切相關(guān)。POD具有多種催化活性，既可以以過氧化氫為電子受體催化酚類物質(zhì)從而清除H2O2，也會隨著植物組織衰老，參與葉綠素的降解和活性氧的生成，進而表現(xiàn)為傷害效應(yīng)[19]。本研究結(jié)果表明，隨著貯藏時間的延長，采后龍眼果肉基因和酶活性均顯著增加，外源EGCG處理在貯藏早期顯著上調(diào)基因的表達，在貯藏末期則極顯著抑制其表達。說明EGCG可能作為信號物質(zhì)，在貯藏早期激活POD酶，并誘導(dǎo)其上調(diào)表達，以清除H2O2；貯藏后期則抑制其表達，提高POD的抗氧化作用并降低其傷害效應(yīng)。以上分析說明，外源EGCG可以提高果實抗氧化酶活性和基因表達，維持其較高的活性氧清除能力，通過上調(diào)影響酶促抗氧化系統(tǒng)，有效降低龍眼果肉受到的氧化損傷。

綜上所述，外源EGCG降低MDA含量累積速率，進而保持細胞完整性，同時維持果肉TSS、TA、AsA含量，有效保持了龍眼果實品質(zhì)。此外，EGCG延緩內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)AsA和GSH含量下降，提高AsA–GSH循環(huán)系統(tǒng)活性氧清除能力。EGCG可能作為信號分子影響抗氧化酶基因、、和表達和相應(yīng)酶活性，維持較高水平的酶促抗氧化系統(tǒng)活力?？傊?，外源EGCG可能通過參與酶促、非酶促抗氧化系統(tǒng)作用，提高果肉組織活性氧清除能力，延緩龍眼果實衰老和品質(zhì)劣變。

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Effect of exogenous EGCG on postharvest longan pulp quality and its underlying mechanism

LAI Yongkai1, ZHOU Yijie2, CHEN Zhongsuzhi2, HE Meiying2, QU Hongxia2, WANG Yongfei1*

(1.College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou, Guangdong 510630, China; 2.South China Botanical Garden, The Academy of Sciences of China, Guangzhou, Guangdong 510630, China)

In order to explore the fresh-keeping effect of EGCG on postharvest longan, the fruits of postharvest longan were soaked in 1 mmol/L EGCG solution for 5 minutes and stored at 25 ℃. On the 2, 4, 6 and 8 days of the storage period, samples were taken to determine the autolysis index of the pulp, the content of endogenous antioxidants, and the activity of antioxidant enzymes. The results showed that at 6 and 8 days after exogenous EGCG treatment, the autolysis index of longan fruits after harvest decreased by 22.56% and 11.70% respectively, compared with the control group; at 8 day after exogenous EGCG treatment, TSS and TA in the pulp were respectively 1.16 and 1.17 times than that in the control. Furthermore, EGCG treatment significantly increased the activities of DHAR and GR, and up-regulated the relative expression of enzyme genes such asand.

longan; epigallocatechin gallate(EGCG); pulp quality; anti-oxidation gene expression

S667.209+.3

A

1007-1032(2020)05-0545-06

來涌凱，周宜潔，陳中蘇直，何妹英，屈紅霞，王永飛．外源EGCG對采后龍眼果肉品質(zhì)的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(5)：545–550．

LAI Y K, ZHOU Y J, CHEN Zhong S Z, HE M Y, QU H X, WANG Y F. Effect of exogenous EGCG on postharvest longan pulp quality and its underlying mechanism[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 545–550.

http://xb.hunau.edu.cn

2020–04–15

2020–08–24

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0400904)；廣東省科學(xué)技術(shù)廳項目(2017A040405044)

來涌凱(1994—)，男，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事采后果蔬保鮮研究，2891169596@qq.com；*通信作者，王永飛，博士，教授，主要從事蔬菜作物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用研究，wyfmsm@163.com

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維