胡超，陳彥成，任春梅，張學(xué)文，黃麗華*

水稻基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

胡超1，陳彥成2,3，任春梅1，張學(xué)文1，黃麗華1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游秈稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.湖南省水稻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

以湘晚秈13號(hào)為材料，克隆了水稻基因啟動(dòng)子，構(gòu)建了啟動(dòng)子與GUS基因融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥。序列分析結(jié)果表明，該啟動(dòng)子包含了啟動(dòng)子核心序列TATA-box和CAAT-box以及光響應(yīng)元件等。GUS染色結(jié)果表明：在擬南芥幼嫩的子葉、下胚軸和真葉中，GUS的表達(dá)較強(qiáng)；隨著葉片的衰老，GUS表達(dá)減弱；在根中，GUS主要在主根的維管柱內(nèi)表達(dá)；黑暗處理會(huì)使GUS表達(dá)減弱；在黑暗條件下，基因表達(dá)下調(diào)。

水稻；擬南芥；延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)；酪氨酸降解途徑；啟動(dòng)子；基因；GUS表達(dá)

在動(dòng)物中，酪氨酸在酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和對(duì)羥基苯丙酮酸雙氧化酶作用下轉(zhuǎn)化成尿黑酸；尿黑酸經(jīng)尿黑酸1,2雙加氧酶、馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)催化，降解為乙酰乙酸和延胡索酸[1]。該降解途徑在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。FAH是酪氨酸降解途徑中的關(guān)鍵酶。FAH活性喪失會(huì)使細(xì)胞積累酪氨酸降解代謝中間產(chǎn)物，促發(fā)動(dòng)物I型酪氨酸血癥[2-4]。在植物中，酪氨酸在酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和對(duì)羥基苯丙酮酸雙氧化酶作用下也轉(zhuǎn)化成尿黑酸[5]。植物zeta類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶具有和動(dòng)物馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶類似的結(jié)構(gòu)和功能[6-7]。擬南芥尿黑酸1,2雙加氧酶、馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶和FAH編碼基因呈現(xiàn)組成型表達(dá),并且它們的體外表達(dá)產(chǎn)物可以將尿黑酸降解為乙酰乙酸和延胡索酸[8-9]。擬南芥FAH功能喪失會(huì)使細(xì)胞積累酪氨酸降解代謝中間產(chǎn)物，使細(xì)胞在短日照下死亡[10-11]。這些結(jié)果表明，植物中也存在一條類似于動(dòng)物的酪氨酸降解途徑，并且該途徑在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育中也發(fā)揮著重要功能。然而，除擬南芥外，酪氨酸降解途徑在其他植物中的功能尚不清楚。

本試驗(yàn)克隆了湘晚秈13號(hào)基因的啟動(dòng)子，并分析了啟動(dòng)子的表達(dá)特征及基因的表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究酪氨酸降解途徑在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

水稻(L.)品種湘晚秈13號(hào)，由農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游秈稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。擬南芥()Columbia生態(tài)型由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2　方法

1.2.1基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

根據(jù)秈稻FAH編碼基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物PROF1(5′-AACCTATTTTCGT TCAGCGCG-3′，下劃線顯示I位點(diǎn))和PROR1 (5′-CATGTGCCGACTCCTCTCTCGT-3′，下劃線顯示I位點(diǎn))。

水稻種子發(fā)芽生長(zhǎng)2周后，采用CTAB法[12]提取葉片DNA。以提取的DNA為模板，PROF1和PROR1為引物，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子序列?？寺∑闻cT載體連接重組后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，菌落PCR檢測(cè)的陽性克隆由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列分析通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和PlantCare數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線進(jìn)行。

1.2.2啟動(dòng)子與GUS基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建

啟動(dòng)子與GUS基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建如圖1?？寺〉膯?dòng)子經(jīng)I和I酶切后，與載體pCAMBIA1301連接重組；重組分子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，酶切檢測(cè)重組載體，并對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。采用電擊法將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。PCR檢測(cè)含重組載體的農(nóng)桿菌。

圖1　OsFAH啟動(dòng)子與GUS基因融合表達(dá)載體

1.2.3擬南芥的轉(zhuǎn)化

擬南芥種子用20%的次氯酸鈉消毒液處理15 min，無菌水洗滌3次后接種于含1%蔗糖的MS培養(yǎng)基中。種子于4 ℃春化3 d后置于光照培養(yǎng)箱(22 ℃，16 h光照、8 h黑暗)中培養(yǎng)。將生長(zhǎng)1周的幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)至開花。參照蔡薇等[13]的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。

1.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和鑒定

轉(zhuǎn)基因植株種子在添加25 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)2周后，挑選生長(zhǎng)正常的植株移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)生長(zhǎng)。采用CTAB法提取水稻幼嫩葉片的DNA[12]。以提取的DNA為模板，PROF2 (5′-GCTTCCGTTCATCTGCGCCTAT-3′)和GUS1 (5′-ACACAAACGGTGATACGTACAC-3′)為引物，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.5擬南芥的黑暗處理及GUS染色

將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周或2周的擬南芥置于溫度為22 ℃的人工氣候箱中，黑暗處理6 h后進(jìn)行GUS染色。

參照蔡薇等[13]的方法進(jìn)行GUS染色。3次重復(fù)。

1.2.6基因表達(dá)分析

將生長(zhǎng)2周的水稻幼苗置于黑暗中處理3、6、9 h后提取葉片的RNA。參照TAKARA公司的RNAiso Plus和PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)秈稻基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物FP1 (5′-CGCCAGGAAACGCTCAAC-3′)和RP1(5′-GTC GCTCATGGGAACAAGG-3′)。以FP1和RP1為引物，18S rRNA為內(nèi)參，參照ROCHE公司的FastStart Universal SYBR Green Master熒光定量PCR試劑盒說明書，于ABI 7300上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。3次重復(fù)?；虮磉_(dá)量按照2-ΔΔCt方法計(jì)算。18S rRNA熒光定量PCR反應(yīng)引物為FP2(5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′)和RP2(5′-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3′)[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1　水稻OsFAH基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

采用PCR法克隆了水稻基因啟動(dòng)子的序列。測(cè)序結(jié)果表明，該序列長(zhǎng)度為2 000 bp，與Genbank中預(yù)測(cè)的序列一致(圖2)。采用PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子包含的元件進(jìn)行分析，結(jié)果(圖3、表1)表明，除了含有核心元件TATA-box和CAAT- box外，啟動(dòng)子還含有光響應(yīng)元件(GT1-motif、Box 4、GATA-motif、MRE、G-box)、厭氧響應(yīng)元件ARE、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif、生物鐘控制元件Circadian及脫落酸響應(yīng)元件ABRE。

M　DNA Marker 1 kb；1　OsFAH啟動(dòng)子。

圖3　OsFAH啟動(dòng)子序列

表1　OsFAH啟動(dòng)子包含的作用元件

2.2　PCR鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥

啟動(dòng)子與載體pCAMBIA1301重組后，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中。培養(yǎng)含重組載體的農(nóng)桿菌，采用浸花序的方法將重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥。將轉(zhuǎn)基因植株種子接種至添加潮霉素的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)，篩選對(duì)潮霉素具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA為模板，啟動(dòng)子序列為上游引物，GUS基因序列為下游引物，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果如圖4所示。從部分轉(zhuǎn)基因植株中擴(kuò)增出目的條帶，說明目的序列已經(jīng)整合至擬南芥基因組中。

M　DNA Marker 2 kb；1　對(duì)照植株；2～11　轉(zhuǎn)基因植株；12　質(zhì)粒陽性對(duì)照。

2.3　轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS的表達(dá)分析

取生長(zhǎng)3、7、14 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥，觀察GUS的表達(dá)。結(jié)果表明：在幼嫩的子葉和真葉中，GUS的表達(dá)量較高(圖5-c、圖5-d)，隨著葉片的衰老，GUS的表達(dá)減弱(圖5-e)；GUS在衰老子葉中的表達(dá)高于其在衰老真葉中的表達(dá)(圖5-e)；在衰老的真葉中，GUS主要在葉尖、葉脈和葉柄處表達(dá)，在葉尖和葉柄處的表達(dá)量較高(圖5-e)；在下胚軸中，GUS也有較高的表達(dá)量(圖5-c)；在根中，GUS僅在根的維管柱內(nèi)表達(dá)，在根毛和根尖中都未表達(dá)(圖5-f、圖5-g)；GUS在側(cè)根中的表達(dá)低于其在主根中的表達(dá)(圖5-h)。

a　非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?；b　35S陽性對(duì)照植株；c　生長(zhǎng)3 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥；d　生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥；e　生長(zhǎng)14 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥；f　根及根毛；g　主根根尖；h　側(cè)根。

2.4　OsFAH啟動(dòng)子對(duì)黑暗處理的響應(yīng)

為探究啟動(dòng)子對(duì)光的響應(yīng)，將轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行黑暗處理后檢測(cè)GUS的表達(dá)。結(jié)果(圖6)顯示，黑暗處理1周和2周，植株真葉和子葉中的GUS表達(dá)均明顯降低。

a　生長(zhǎng)1周的對(duì)照植株；b　黑暗處理1周的植株；c　生長(zhǎng)2周的對(duì)照植株；d　黑暗處理2周的植株。

2.5　黑暗處理對(duì)OsFAH基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究表達(dá)對(duì)光的響應(yīng)，對(duì)基因在黑暗條件下的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果(圖7)顯示，黑暗處理使表達(dá)下調(diào)；黑暗處理3 h，的相對(duì)表達(dá)量降低了約70%；黑暗處理6 h或9 h，其表達(dá)量降低了約80%。

圖7　OsFAH基因在黑暗條件下的相對(duì)表達(dá)量

3　結(jié)論與討論

啟動(dòng)子是位于基因上游一段調(diào)控基因表達(dá)的DNA序列[15-16]。通過對(duì)目的基因啟動(dòng)子序列特征和表達(dá)特征的研究，可以揭示目的基因的表達(dá)特征及其調(diào)控模式，從而預(yù)測(cè)該基因的功能。FAH是酪氨酸降解途徑中的關(guān)鍵酶。為了探究酪氨酸降解途徑在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，本研究中，從湘晚秈13號(hào)中克隆了基因的啟動(dòng)子，序列分析結(jié)果表明，該啟動(dòng)子含有TATA-box和CAAT-box，這2個(gè)元件是真核生物啟動(dòng)子的核心序列，決定著轉(zhuǎn)錄的起始和強(qiáng)度[17]；啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥中表達(dá)，說明該啟動(dòng)子不但具有真核生物啟動(dòng)子的基本特征，而且具有表達(dá)活性。啟動(dòng)子含有許多光響應(yīng)元件，如G-box和GT1-motif等。G-box普遍存在于光調(diào)控基因的啟動(dòng)子中，一些轉(zhuǎn)錄因子(如HY5)與G-box結(jié)合，調(diào)控啟動(dòng)子對(duì)光的響應(yīng)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[18]。GT1-motif是基因響應(yīng)光信號(hào)的必要元件[19]。在黑暗條件下，表達(dá)下調(diào)可能與啟動(dòng)子含有這些光響應(yīng)元件相關(guān)。擬南芥酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿黑酸1,2雙加氧酶和馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶基因的表達(dá)都受到光的調(diào)控[20]。在不同光周期下，擬南芥FAH基因表達(dá)不同；FAH突變體在長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)正常，在短日照下會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死亡[21]。這些結(jié)果表明，酪氨酸降解途徑可能參與了植物對(duì)光的響應(yīng)。此外，啟動(dòng)子還包含了脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、生物鐘控制元件以及厭氧響應(yīng)元件，說明表達(dá)可能還受到脫落酸等因素的調(diào)控。

擬南芥FAH編碼基因在不同組織中都有表達(dá)[9]。啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS在擬南芥的葉片、下胚軸及根中表達(dá)，說明水稻基因與擬南芥FAH編碼基因一樣，在不同組織中都有表達(dá)。然而，相對(duì)于衰老組織，GUS在幼嫩組織中的表達(dá)較強(qiáng)；相對(duì)于根，GUS在地上部分組織中的表達(dá)較強(qiáng)。這些結(jié)果表明，啟動(dòng)子在幼嫩組織和地上部分組織中具有較強(qiáng)的表達(dá)活性，暗示該基因可能在水稻幼嫩組織及地上部分組織的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著更重要的功能。在根中，GUS表達(dá)僅限于在維管柱中，暗示可能參與了根中物質(zhì)的運(yùn)輸過程。

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Cloning and expression analysis ofpromoter in rice

HU Chao1, CHEN Yancheng2,3, REN Chunmei1, ZHANG Xuewen1, HUANG Lihua1*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Key Laboratory of Indica Rice Genetics and Breeding in the Middle and Lower Reaches ofYangtze River Valley, Ministry of Agriculture, P.R. China, Changsha, Hunan 410125, China; 3.Hunan Rice Research Institute, Changsha, Hunan 410125, China)

The promoter ofgene was cloned fromcultivar ‘Xiangwanxian 13’, and analyzed for the presence of putative-elements. Thepromoter contained basal promoter elements, TATA-box, CAAT-box, and the-elements involved in light response. The promoter was cloned into a vector that contains the GUS gene, and introduced into. GUS expression in the transgenicwas detected by histochemical staining. Strong GUS expression was observed in young cotyledons, hypocotyls, and true leaves. However, low GUS expression was only detected in old leaves. GUS expression was found in the vascular tissues of the taproots. And, GUS expression driven bypromoter andexpression were decreased when plants were exposed to darkness.

;; fumarylacetoacetate hydrolase; tyrosine degradation pathway; promoter;gene; GUS expression

S511；Q786

A

1007-1032(2020)05-0527-06

胡超，陳彥成，任春梅，張學(xué)文，黃麗華．水稻基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(5)：527-532．

HU C, CHEN Y C, REN C M, ZHANG X W, HUANG L H. Cloning and expression analysis ofpromoter in rice[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 527-532.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-16

2019-12-27

湖南省教育廳項(xiàng)目(18A100)；農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游秈稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2018KLMA03)

胡超(1973—)，男，湖南郴州人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，13574852690@163.com，主要從事植物生物化學(xué)研究；*通信作者，黃麗華，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究，lihua30001@sina.com

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正