郭秋菊 馮安平 陳開明 黃劍虹

[摘要]骨科植入物相關(guān)感染中形成生物膜的最常見致病菌是金黃色葡萄球菌。深入研究金黃色葡萄球菌生物膜的形成過程，對(duì)骨科植入物相關(guān)感染的治療至關(guān)重要。細(xì)菌黏附于宿主是形成生物膜的關(guān)鍵的第一步，成熟后的生物膜中細(xì)菌的生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生顯著變化。總之，生物膜是結(jié)構(gòu)復(fù)雜和功能協(xié)調(diào)的有機(jī)體。

[關(guān)鍵詞]金黃色葡萄球菌;生物膜;黏附

[中圖分類號(hào)] R378.1+1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）9（a）-0023-04

[Abstract] The most common pathogens of biofilm in orthopedic department implant-related infections is Staphylococcus aureus. It is very important to study the formation process of Staphylococcus aureus biofilm for the treatment of orthopedic implant-related infections. Bacterial adhesion in host is the key first step of biofilm formation. After maturation， the physiological state of bacteria in the biofilm will change significantly. In a word， biofilm is an organism， which has complex structure and coordinating function.

[Key words] Staphylococcus aureus; Biofilms; Adherence

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是骨科植入物相關(guān)感染的主要致病細(xì)菌[1]。SA可通過植入物植入或一過性的菌血癥等途徑黏附于植入物材料表面并形成細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm，BBF）[2]。BBF是包裹在自身產(chǎn)生的聚合物基質(zhì)中，并黏附在植入物或組織細(xì)胞等宿主表面上的，具有高度結(jié)構(gòu)化的細(xì)菌群體[3]。BBF由細(xì)菌及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）組成，其中細(xì)菌約占15%[4]。迄今為止，對(duì)于BBF相關(guān)感染仍然沒有明確有效的治療方法[5]。SA是BBF相關(guān)感染的主要致病細(xì)菌[6]，對(duì)SA的BBF形成過程進(jìn)行研究有助于對(duì)SA相關(guān)感染的防治提供思路[7]。Lohse等[8]認(rèn)為，目前對(duì)BBF形成過程的研究主要是基于體外實(shí)驗(yàn)、感染的動(dòng)物體內(nèi)模型以及臨床醫(yī)療設(shè)備上形成的BBF的觀測(cè)，在這些觀測(cè)的基礎(chǔ)上，BBF的形成過程大致被分為4個(gè)階段，分別為黏附、增殖、成熟及播散。

1黏附

SA黏附于宿主表面是SA引發(fā)骨科植入物相關(guān)感染的起始動(dòng)因[9]。目前，對(duì)于SA如何黏附并定植于宿主表面的詳細(xì)機(jī)制并不完全清楚。Lohse等[8]發(fā)現(xiàn)，SA中參與群體感應(yīng)（quoromsensing，QS）的分子、宿主表面的性質(zhì)、宿主中的激素以及其他相互作用的微生物的存在均可影響?zhàn)じ诫A段的完成。

1.1 SA的黏附過程

當(dāng)浮游狀態(tài)的SA游動(dòng)到宿主表面時(shí)，會(huì)黏附在其表面。這一初始黏附過程需依靠范德華力、疏水性、表面電荷和表面張力等作用力來完成，但同時(shí)需克服SA與宿主表面的排斥力[10]。因此，這一初始黏附過程是選擇性的、可逆的、不穩(wěn)定的[11]。一旦浮游SA完成在組織細(xì)胞等宿主表面的初始黏附，鑲嵌在SA表面肽聚糖上的一些分泌蛋白，如細(xì)胞外黏附蛋白和細(xì)胞壁錨定蛋白等黏附分子可以介導(dǎo)SA進(jìn)一步黏附在組織細(xì)胞表面;細(xì)胞外黏附蛋白和細(xì)胞壁錨定蛋白的缺失可以顯著降低BBF的堅(jiān)固性和厚度，但是這些蛋白之間的功能關(guān)系尚不清楚[12]。Grimm等[13]認(rèn)為細(xì)菌表面的黏附分子能與組織細(xì)胞內(nèi)的膠原蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和纖連蛋白等結(jié)合;然后，細(xì)菌開始從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)并交換DNA，于是細(xì)菌發(fā)生特異的不可逆黏附。另外，人體內(nèi)的血漿蛋白等大分子物質(zhì)能吸附在植入物等宿主表面，這能為浮游細(xì)菌的黏附提供基質(zhì)，有助于浮游細(xì)菌在植入物等宿主表面形成牢固的黏附[14]。

1.2黏附過程中的調(diào)控機(jī)制

SA具有廣泛且冗余的毒力基因庫，能夠在逃避宿主免疫應(yīng)答的同時(shí)黏附并定植和破壞宿主[15]。有專家認(rèn)為，在黏附過程中，細(xì)菌與組織細(xì)胞內(nèi)的膠原蛋白的結(jié)合能力主要是由Pil1基因調(diào)控[13]，而此結(jié)合能力是細(xì)菌毒性的重要特征。在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）形成BBF時(shí)，黏附過程參與的基因很多，在眾多的基因中，fnbA、clfA、clfB或cna等是介導(dǎo)MRSA完成黏附階段所必需的基因[16]。另有研究表明，巨噬細(xì)胞能分泌溶菌酶，細(xì)菌中的mccF、cinA等與免疫相關(guān)的基因在溶菌酶的觸發(fā)作用下會(huì)表現(xiàn)出高表達(dá)，溶菌酶能刺激細(xì)菌在人體內(nèi)更快速地形成BBF[13]。還有專家認(rèn)為，多種細(xì)菌的共生存在也會(huì)相互激發(fā)從而促進(jìn)BBF的形成[9]。黏附后的SA聚集在一起，會(huì)產(chǎn)生QS系統(tǒng)等調(diào)控機(jī)制;QS系統(tǒng)是細(xì)菌監(jiān)測(cè)菌群分布并感知周圍培養(yǎng)環(huán)境的重要機(jī)制，主要受agr等基因控制;SA通過QS系統(tǒng)介導(dǎo)特定基因的表達(dá)，從而調(diào)控SA的行為[17]。

2增殖

2.1 ECM中的成分

SA黏附于宿主表面后開始大量分泌ECM。ECM的主要成分是胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）和蛋白質(zhì)等，其中每種成分的量隨菌株和培養(yǎng)條件的不同而不同[12]。eDNA來自細(xì)菌的裂解產(chǎn)物，其對(duì)于細(xì)菌與宿主的初步黏附很重要，并有助于維持BBF結(jié)構(gòu)。有專家認(rèn)為，在ECM中，eDNA是最常見的成分[6]，或許可以將eDNA作為針對(duì)SA的BBF根除策略的主要目標(biāo)。但是eDNA的含量與BBF形成能力之間不相關(guān)，eDNA在BBF形成和結(jié)構(gòu)完整性方面的作用可能取決于PIA等基質(zhì)的含量和作用。PIA是由icaADBC操縱子編碼的蛋白質(zhì)執(zhí)行生物合成而產(chǎn)生，是細(xì)菌聚集和形成BBF的主要生物分子[18]。在ECM中，PIA具有很重要的作用，能介導(dǎo)細(xì)菌分泌胞外多糖等黏液成分，并能促使細(xì)菌之間相互聚集、增加細(xì)菌與宿主之間黏附的牢固程度、抵御機(jī)體的免疫反應(yīng)和抗生素的侵襲[19]。據(jù)報(bào)道，MRSA常產(chǎn)生不依賴PIA的BBF，該類BBF含有較多的eDNA，并且對(duì)脫氧核糖核酸酶Ⅰ治療敏感[6];相反，PIA依賴性BBF通常產(chǎn)生于對(duì)甲氧西林敏感的SA中，其含有較少的eDNA，并且對(duì)脫氧核糖核酸酶Ⅰ具有抗性。目前，ECM中各種成分的作用及其在不同菌株BBF中的關(guān)系尚未完全清楚[6]。

2.2增殖過程中的調(diào)控機(jī)制

黏附在宿主表面的SA會(huì)聚集在一起，快速生長，并在QS系統(tǒng)的引導(dǎo)下分泌ECM。ECM的產(chǎn)生取決于培養(yǎng)環(huán)境和控制BBF形成的調(diào)節(jié)因子的功能改變[4]。涉及ECM形成的調(diào)控機(jī)制很復(fù)雜。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞外蛋白酶（Aur，SpL，SspA和SspB）、熱核酸酶（Nuc）、自溶素（LytM，LytN和AtlA）、毒素（PSMα，PSMβ和δ-溶血素）、穴蛋白/抗霍亂分子（CidA和LrgAB）、雙組分系統(tǒng)（Agr，WalKR，LytSR，SaeRS，ArlRS和SrrAB）、全局調(diào)節(jié)因子（SigB，SarA，MgrA和Rot）和非編碼RNA（msaABCR）都直接或間接調(diào)節(jié)ECM形成，其中起調(diào)節(jié)作用的必須因子是SigB[4]。SigB是在調(diào)節(jié)SA的BBF形成、毒力表達(dá)和色素合成中起重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，當(dāng)SigB的表達(dá)增加時(shí)SA形成BBF的能力增強(qiáng)，而sigB缺失的突變體則不能形成BBF。

3成熟

3.1 BBF的成熟過程

在成熟過程中，ECM可將SA包裹在一起，形成蘑菇狀的小菌落。這些小菌落在化學(xué)信號(hào)分子的引導(dǎo)下形成水通道和氣孔等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，用以運(yùn)送SA新陳代謝所需的酶、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等，并進(jìn)一步加強(qiáng)BBF內(nèi)細(xì)菌之間的聯(lián)系，產(chǎn)生協(xié)調(diào)的群體行為。有研究顯示，在小菌落形成水通道和氣孔等結(jié)構(gòu)的過程中，酚溶性調(diào)控蛋白（phenol-soluble modulins，PSMs）是起重要作用的效應(yīng)分子[20]。PSMs是一種表面活性劑，能破壞ECM中大分子間的起靜電或疏水作用的非共價(jià)鍵。在PSMs的作用下，一些細(xì)菌與細(xì)菌之間的黏附會(huì)逐漸被瓦解，進(jìn)而形成微孔道。成熟后的BBF中的ECM的主要成分是糖蛋白。Lohse等[8]發(fā)現(xiàn)，通過質(zhì)譜法已經(jīng)在ECM中鑒定出500多種蛋白質(zhì)，許多是酶，其中的一些酶缺乏規(guī)范的分泌序列，不太可能是細(xì)菌分泌的酶，而可能是細(xì)菌的裂解產(chǎn)物。

3.2成熟后的BBF的生理狀態(tài)

成熟后的BBF內(nèi)的SA的生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生顯著變化。Archer等[21]發(fā)現(xiàn)，在BBF的成熟過程中，BBF內(nèi)的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和電子受體的梯度變化會(huì)導(dǎo)致整個(gè)BBF的異質(zhì)基因表達(dá)。在SA的體外BBF模型中，SA有4種不同的代謝狀態(tài)，即需氧、發(fā)酵、休眠和死亡的SA。大多數(shù)SA處于休眠狀態(tài)并處于缺氧環(huán)境中，但暴露于含氧的空氣界面和富含營養(yǎng)素的液體界面的SA具有顯著的代謝活性。這種現(xiàn)象可能是由于密集的細(xì)菌和ECM的屏障作用，使得在BBF里層的細(xì)菌營養(yǎng)供給不足，生長速度受到限制所致。當(dāng)發(fā)生機(jī)體免疫反應(yīng)和抗生素侵襲導(dǎo)致BBF外周環(huán)境中的浮游細(xì)菌減少時(shí)，BBF里層的處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌便可復(fù)蘇和釋放到外周環(huán)境中，形成新的感染灶。BBF的代謝活動(dòng)受到表面環(huán)境條件和誘導(dǎo)黏附的特定基因表達(dá)的控制，低細(xì)胞代謝能增加SA對(duì)抗生素的抗性[22]。BBF的抗生素耐受性也與抗生素敏感SA的同基因亞群的出現(xiàn)有關(guān)，這些SA由于隨機(jī)誘導(dǎo)的休眠狀態(tài)而獲得對(duì)多種抗生素的耐受性[6]。因此，當(dāng)人體組織細(xì)胞或骨科植入物等宿主表面上有成熟的BBF形成時(shí)，其常引起慢性感染。

4播散

成熟后的BBF中的細(xì)菌逐漸增多而變得擁擠。當(dāng)SA密度達(dá)到一定閾值時(shí)便會(huì)觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，部分SA就會(huì)從BBF中解離出來，重新變成游離狀態(tài)進(jìn)行遠(yuǎn)處播散。成熟后的BBF在相關(guān)基因的調(diào)控下會(huì)分泌表面活性劑或細(xì)胞外酶等物質(zhì)，個(gè)別細(xì)菌或小菌落可以通過這些物質(zhì)自我調(diào)動(dòng)和從BBF中解離脫落，重新變成浮游細(xì)菌，并尋找新的環(huán)境，重新繁殖并擴(kuò)大BBF的規(guī)模，使之不斷成熟。BBF的解離方式可能有多種，其中常見的可能有兩種，具體如下。①生物解離：成熟后的BBF會(huì)分泌多種細(xì)胞外酶，如半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等。這些細(xì)胞外酶能夠降解ECM中的蛋白成分，破壞SA間的黏附，使得BBF穩(wěn)定性下降。然而，敲除這些細(xì)胞外酶的基因能明顯抑制BBF的解離過程[23]。②化學(xué)解離：諸如PSMs之類的表面活性劑能破壞ECM中大分子之間的非共價(jià)鍵從而使BBF解離。這一階段是BBF維持感染并進(jìn)一步擴(kuò)散感染的重要環(huán)節(jié)，所以這一階段在BBF形成過程中，特別是慢性感染機(jī)制中尤為重要。

5總結(jié)與展望

SA的BBF的形成過程涉及多種基因、蛋白質(zhì)以及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。目前，對(duì)SA的BBF的形成過程和調(diào)控機(jī)制的研究尚未完全清楚[17]，如鑲嵌在SA表面肽聚糖上的細(xì)胞外黏附蛋白和細(xì)胞壁錨定蛋白等黏附分子在BBF的形成和致病性中具有獨(dú)特作用。目前，這些蛋白之間的功能關(guān)系并不清楚。然而，研究清楚這些蛋白之間的功能關(guān)系可能為控制SA的BBF感染提供新的策略[12]。icaA和icaD基因能通過介導(dǎo)PIA的合成確定SA產(chǎn)生BBF的能力，這表明ica基因位點(diǎn)有可能是治療SA引起的植入物相關(guān)感染的良好靶標(biāo)[7]，值得進(jìn)一步研究?？偠灾?，深入研究SA的BBF形成過程可能有助于對(duì)SA的相關(guān)感染進(jìn)行治療，尤其是慢性感染的治療。

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（收稿日期：2020-04-14）