楊曉娜 張星和 楊麗華 宋志姣 李曉嬌 侯洪波

（保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院 云南保山 678000）

精油是從植物的花、葉、莖、根或果實中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法提煉萃取的揮發(fā)性芳香物質(zhì)的總稱［1］?；瘜W(xué)成分較為復(fù)雜，一般都具有抑菌、抗炎、抗氧化、殺蟲等多種生物活性［2］。絨毛香茶菜（Plectranthus hadiensisvar.tomentosus），唇形科香茶菜屬，多年生灌木狀草本植物，又因其香味濃甜，頗似蘋果香味，故又享有“蘋果香”美譽［3］。

目前，國內(nèi)、外對絨毛香茶菜的研究集中在植物化學(xué)［3-6］、抑菌［7-8］、栽培［9-10］及生理［11-13］等方面。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，尚未檢索到有關(guān)不同提取方法提取的絨毛香茶菜精油成分測定及其抗氧化活性的比較研究。本文用GC-MS 分別對微波輔助水蒸氣蒸餾法和超聲波輔助水蒸氣蒸餾法獲得的精油進(jìn)行化學(xué)成分分析，比較不同提取方法下絨毛香茶菜精油成分的差異和體外抗氧化能力的差異。一方面為弄清其生理功能，從而為進(jìn)行有效提取分離純化技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)；另一方面，比較精油成分的差異，為進(jìn)一步對精油活性研究比較提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。同時，加速植物藥用資源的有效開發(fā)利用，為揮發(fā)精油在醫(yī)藥、食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 新鮮絨毛香茶菜全株（月齡3～5 個月，根莖部未木質(zhì)化），采購于江蘇省宿遷市沭陽縣夢溪園藝植物園。

DPPH（美國Sigma 公司）、ABTS 分析純（美國Sigma 公司）、Tris（美國Amresco 公司）、連苯三酚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等；所有有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 Trace DSQ GC-MS（賽默飛世爾科技有限公司）、SB-3200DT 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）、G70F20N2L-DG（S0）微波爐（廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司）、DZTW 型調(diào)溫電熱套（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）及XBLL-25A 勻漿機（上海帥佳電子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 2種提取絨毛香茶菜精油的方法 1）微波輔助水蒸氣蒸餾法：稱取一定量的絨毛香茶菜鮮葉，料液比為1∶6（g／mL），勻漿至流體狀（即無大顆粒樣品），浸泡1 h 后，將預(yù)處理好的樣品填充至蒸餾瓶中。微波爐中調(diào)至252 W 進(jìn)行2 min微波處理，加入幾粒沸石或小玻璃珠，蒸餾3～4 h，至精油餾量不再增加，收集油水分離器中上層的油層，得到具有特殊香氣的精油，用無水硫酸鈉干燥后于-20℃密封保存。提取過程重復(fù)操作3 次。計算該方法的精油提取率，即精油質(zhì)量與樣品質(zhì)量的比值。2）超聲波輔助水蒸氣蒸餾法：精油富集、保存等操作與微波水蒸氣蒸餾法操作相同。不同在于后者是超聲波180 W 調(diào)至30℃進(jìn)行20 min超聲處理。

1.3.2 絨毛香茶菜精油的GC-MS 分析方法GC 條件：色譜柱：DB-17 型石英毛細(xì)柱管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始50℃，保持5 min，5℃／min 升溫至90℃，20℃／min 升溫至120℃，保持1 min，10℃／min 升溫至210℃，保持5 min，10℃／min 升溫至240℃，40℃／min 升溫至280℃，保持5 min；載氣：He；進(jìn)樣口溫度：230℃；進(jìn)樣流量：1.0 mL／min。

MS 條件：離子源：EI；電離能：70 eV；離子源溫度：200℃；掃描質(zhì)量范圍（m／z）：20～500 amu。質(zhì)譜庫：NIST05s.LIB 和NIST05.LIB 譜庫。

1.3.3 絨毛香茶菜精油體外抗氧化能力的測定方法

1.3.3.1 DPPH 自由基清除法 參照Ahmad N.等［14］的方法，取相同體積的樣品溶液和0.2 mmol／L的DPPH 溶液2 mL，混勻反應(yīng)30 min；以無水乙醇作對照，測定517 nm 處的吸光值A(chǔ)；同樣測定2 mL樣品溶液與2 mL 無水乙醇混合液在517 nm 處的吸光值A(chǔ)0；再測定2 mL DPPH 溶液與2 mL 無水乙醇混合液在517 nm 處的吸光值A(chǔ)1（重復(fù)3 次）；計算清除率：清除率=［1-（A-A0）／A1］×100%。

1.3.3.2 ABTS 自由基清除法 參照Delgado-Andrade 等［15］的方法，用無水乙醇配制不同質(zhì)量濃度的精油，使得VC 配制的溶液濃度和精油的濃度一致。取0.1 mL 樣品溶液，加入3.9 mL ABTS 自由基溶液，在734 nm 處測其吸光值A(chǔ)；再取0.1 mL無水乙醇溶液，加入3.9 mL ABTS 自由基溶液，同上測定其在734 nm 處的吸光值A(chǔ)0（重復(fù)3 次）；計算清除率：清除率=［（A0-A）／A0］×100%。

1.3.3.3 超氧陰離子自由基清除法 參照李熙燦的方法［16］，用無水乙醇配制不同質(zhì)量濃度的精油，使得VC 配制的溶液濃度和精油的一致。取2 950 μL Tris-HCl 緩沖液加入到石英比色皿中，再添加50 μL 連苯三酚溶液，迅速混合，開始計時，每隔30 s 在325 nm 處讀數(shù)一次A值，至300 s為止，其中空白參比為Tris-HCl 緩沖液。計算得ΔA0=A325nm，300s～A325nm，30s。取50 μL 樣品溶液加入到比色皿中，再添加2 900 μL Tris-HCl 緩沖液，再添加50 μL 連苯三酚溶液，迅速混合（顛覆式），開始計時，每隔30 s 在325 nm 處讀數(shù)一次A值，至300 s 時為止，其中空白參比為Tris-HCl 緩沖液。計算得ΔA=A325nm，300s～A325nm，30s。對照樣品VC溶液重復(fù)樣品測量操作。計算清除率：清除率=［（ΔA0-ΔA）／ΔA0］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法提取絨毛香茶菜精油的提取率比較分析 微波輔助水蒸氣蒸餾法和超聲波輔助水蒸氣蒸餾法對絨毛香茶菜精油的提取均具有可行性。從提取率分析，微波輔助水蒸氣蒸餾法效率較高為0.56%，超聲波輔助水蒸氣蒸餾法為0.47%。由于超聲波的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)及微波的電磁場作用影響，對植物細(xì)胞內(nèi)含物的釋放具有促進(jìn)作用。

2.2 微波輔助水蒸氣蒸餾法法提取的絨毛香茶菜精油成分分析 微波輔助水蒸氣蒸餾法法提取的絨毛香茶菜精油GC-MS 總離子色譜圖見圖1。經(jīng)過GC-MS 分析微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油成分共有65 種，其中4-羥基-4-甲基-2-戊酮（23.23%）相對含量最高，其次是D-檸檬烯（14.98%）、Podocarp-7-en-3β-ol、13β-methyl-13-vinyl-（13.62%）和α-萜品烯（6.06%）。

圖1 微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油GC-MS 總離子色譜圖

2.3 超聲波法提取的絨毛香茶菜精油成分分析超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油GC-MS 總離子色譜圖見圖2。經(jīng)過GC-MS 分析超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油成分共有6 種，其中4-羥基-4-甲基-2-戊酮（42.53%）相對含量最高，其次是檸檬烯（39.17%）、萜品油烯（14.31%）和間異丙基甲苯（2.21%）。

圖2 超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油GC-MS 總離子色譜圖

2.4 2種方法提取的絨毛香茶菜精油成分分析比較分析 如表1所示，可知2 種方法提取的絨毛香茶菜精油成分中主要為烯烴類與酮類，其中烯烴類化合物成分，超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油（54.3%），微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油（39.2%）；酮類化合物成分超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油占比最高（42.53%），微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油（27.78%）。2 種方法提取的絨毛香茶菜精油成分中，微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油包含化合物種類最多，其次是超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油。

表1 2 種方法提取的絨毛香茶菜精油成分分類比較

2.5 2種方法提取的絨毛香茶菜精油體外抗氧化能力分析

2.5.1 2種方法提取的絨毛香茶菜精油對DPPH自由基清除率比較 實驗中樣品共設(shè)置5 個濃度梯度即（200～1 000）μg／mL，由圖3可知，2 種方法提取的絨毛香茶菜精油溶液對DPPH 自由基清除率均未超過VC 陽性對照組（濃度梯度內(nèi)清除率為90.78%～91.94%）。其中超聲波輔助水蒸氣蒸餾法組精油DPPH 自由基清除力（濃度梯度內(nèi)清除率為71.38%～81.78%）優(yōu)于微波輔助水蒸氣蒸餾法組精油（濃度梯度內(nèi)清除率為72.17%～75.34%）。

圖3 2 種方法提取的絨毛香茶菜精油和VC 對DPPH 自由基清除率

2.5.2 2種方法提取的絨毛香茶菜精油對ABTS自由基清除率比較 實驗中樣品共設(shè)置5 個濃度梯度即（200～1 000）μg／mL，由圖4可知，2 種方法提取的絨毛香茶菜精油溶液對ABTS 自由基清除率均未超過VC 陽性對照組（濃度梯度內(nèi)清除率為95.32%～99.69%）。其中超聲波輔助水蒸氣蒸餾法組精油ABTS 自由基清除力（濃度梯度內(nèi)清除率為55.79%～98.55%）優(yōu)于微波輔助水蒸氣蒸餾法組精油（濃度梯度內(nèi)清除率為45.92%～52.63%）。

圖4 2 種方法提取的絨毛香茶菜精油對ABTS 自由基清除率

2.5.3 2 種方法提取的絨毛香茶菜精油對超氧陰離子自由基清除率比較 實驗中樣品共設(shè)置5 個濃度梯度即（200～1 000）μg／mL，由圖5可知，微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油溶液對超氧陰離子自由基清除率在（600～1 000）μg／mL 濃度區(qū)間超過VC 陽性對照組（濃度梯度內(nèi)清除率為92.46%～100.00%）。其中微波輔助水蒸氣蒸餾法組精油超氧陰離子自由基清除力（濃度梯度內(nèi)清除率為81.24%～100.00%）優(yōu)于超聲波輔助水蒸氣蒸餾法組精油（濃度梯度內(nèi)清除率為72.70%～83.82%）。

圖5 2 種方法提取的絨毛香茶菜精油對超氧陰離子自由基清除率

2.5.4 2種方法提取的絨毛香茶菜精油抗氧化活性比較分析 通過比較2 種方法提取的絨毛香茶菜精油在不同抗氧化體系下的抗氧化活性可知，絨毛香茶菜精油在（200～1 000）μg／mL 濃度梯度范圍內(nèi)對DPPH 自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子的清除率均隨著濃度的增加而增加。精油是各種揮發(fā)性化學(xué)成分的混合物，清除自由基的能力是各種化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果。黃酮類、萜類、有機酸等物質(zhì)是抗氧化的有效成分，且具有較好的金屬離子的能力。絨毛香茶菜精油的主要成分是烯烴類和酮類，可推測烯烴類和酮類化合物及其衍生物在不同抗氧化體系下具有顯著的抗氧化作用。之所以出現(xiàn)不同方法提取的精油在不同的抗氧化能力評價體系中存在差異，正因為不同方法提取的精油組分不同，不同組分的抗氧化活性不同。

3 討論

在成分方面，本實驗由GC-MS 測試結(jié)果顯示絨毛香茶菜精油主要成分為烯烴類及酮類，其中采用水蒸汽蒸餾法提取得到的精油檸檬烯（36.64%）相對含量最高，與趙小珍等［3］的研究結(jié)果相似；但分別采用微波和超聲波輔助水蒸汽蒸餾法得到的精油主要成分為4-羥基-4-甲基-2-戊酮，且成分種類多于水蒸汽蒸餾法得到的精油，推測主要原因是輔助提取手段對細(xì)胞的破壁作用所導(dǎo)致。同樣的現(xiàn)象出現(xiàn)在薛山［17］對不同提取方法下紫蘇葉精油成分組成研究中及趙海伊等［18］對3 種不同方法提取牛至揮發(fā)精油的化學(xué)成分比較研究中。

在抗氧化活性方面，對絨毛香茶菜精油抗氧化活性的研究少有報道。實驗中微波輔助水蒸氣蒸餾法提取的絨毛香茶菜精油溶液對超氧陰離子自由基清除率在（600～1 000）μg／mL 濃度區(qū)間超過VC 陽性對照組（濃度梯度內(nèi)清除率為92.46%～100.00%）。對比薛山［17］不同提取方法下紫蘇葉精油抗氧化功效研究同樣出現(xiàn)實驗組抗氧化活性超過VC 陽性對照組的現(xiàn)象，推測其較高的抗氧化活性可能得益于絨毛香茶菜精油中較高含量的烯、醇類物質(zhì)。

4 結(jié)論

從提取率來看，微波輔助水蒸氣蒸餾法要優(yōu)于超聲波輔助水蒸氣蒸餾法，提取率達(dá)到0.56%。由GC-MS 測試結(jié)果顯示，絨毛香茶菜精油主要成分為烯烴類及酮類，2 種方法提取的絨毛香茶菜精油成分中4-羥基-4-甲基-2-戊酮最多（相對含量在23.23%～42.53%之間），其次是α-萜品烯、萜品油烯、雙戊烯和D-檸檬烯。但在，2 種提取法得到精油成分中組分及含量均存在一定差異。在不同的抗氧化能力評價體系中證實，2 種方法提取的絨毛香茶菜精油在（200～1 000）μg／mL濃度梯度范圍內(nèi)均有較強的抗氧化活性，且與精油濃度梯度成正相關(guān)。