張慧明 富堯 白淑菊 劉爽 呂冬云
(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002;2生命科學(xué)學(xué)院)
前列腺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率呈逐年上升的趨勢(shì),早期診斷可以通過(guò)手術(shù)治療提高前列腺癌患者的治愈率〔1〕。然而,晚期前列腺癌患者的死亡率較高,同時(shí)患者存在癌細(xì)胞多器官轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象〔2〕?;瘜W(xué)療法在前列腺癌患者晚期治療階段起重要的作用,但是化學(xué)療法比較敏感,治療過(guò)程中機(jī)體會(huì)對(duì)化學(xué)藥物產(chǎn)生抗性,一旦復(fù)發(fā)化學(xué)療法由于抗化學(xué)性而變得無(wú)效〔3〕,需要尋找安全并且長(zhǎng)久的靶向藥物來(lái)治療并減緩癌癥的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。
實(shí)驗(yàn)證明,中藥對(duì)于惡性腫瘤有著很好療效〔4〕。地鱉蟲(chóng)(ESW)是眾多常用作食物的昆蟲(chóng)之一,是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥,從古至今被用于治療許多不同的疾病,如瘀斑、創(chuàng)傷后傷口、肝纖維化和腫瘤。ESW有效成分中纖維蛋白物質(zhì)抗腫瘤作用有報(bào)道〔5〕,但其醇提物對(duì)前列腺癌的作用方式尚未明確,本實(shí)驗(yàn)研究ESW無(wú)水乙醇提取物(ESWE)抗腫瘤作用和潛在的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
1.1材料 ESW粉末(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng):編號(hào)121533),PC3細(xì)胞,DMEM高糖培養(yǎng)液,F(xiàn)-12培養(yǎng)液,胎牛血清(FBS)Gibco進(jìn)口分裝,青霉素,鏈霉素,吖啶橙溴乙錠(AO/EB)試劑盒(品牌solarbio),實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(生工生物公司),磷酸鹽緩沖液(PBS),無(wú)水乙醇,培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)皿等。細(xì)胞購(gòu)于博士德公司。
1.2儀器 激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯FV1000),倒置顯微鏡(萊卡),酶標(biāo)儀(BioTek),超聲機(jī)(KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲機(jī)),豎式電泳儀(北京六一)。
1.3細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)博士德生物科技有限公司,PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的F-12培養(yǎng)液中,均在37℃,5%的CO2條件下培養(yǎng)。
1.4醇提物的制備 將ESW粉末在無(wú)水乙醇中浸泡6 h,超聲溫度50℃,超聲時(shí)間40 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提純,醇提物溶于二甲基亞砜(DMSO)4℃儲(chǔ)存,對(duì)照組加入相同劑量DMSO作為對(duì)照。
1.5ESWE對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 將PC3細(xì)胞(1×104個(gè))在96孔板中培養(yǎng),醇提物濃度梯度為2、4、6、8、10、12 mg/ml。種板后24 h加藥同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔。藥物作用48 h。加入CCK8液100 μl/孔(CCK8∶培養(yǎng)液=1∶9),1 h后酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)吸光度值A(chǔ)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。Graphpad軟件分析IC50值。
1.6劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞PC3(1×105個(gè))接種于6孔板,3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞生長(zhǎng)完全融合后,用黃色的槍頭在孔板底部輕輕劃直線,PBS清洗2次繼續(xù)培養(yǎng)。取藥物濃度低劑量(2.0 mg/ml)、高劑量(4.0 mg/ml)為實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)為對(duì)照組。藥物作用48 h,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞融合度并拍照。PC3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力用劃痕愈合百分率來(lái)表示。
1.7遷移侵襲實(shí)驗(yàn) transwell小室做細(xì)胞遷移侵襲能力測(cè)定,將PC3細(xì)胞血清饑餓24 h,然后在含有醇提物的無(wú)血清培養(yǎng)基中鋪板(1×104細(xì)胞/孔)在24孔板的上室中濃度為2.0 mg/ml,4.0 mg/ml。下室填充1.5 ml含有10%FBS的培養(yǎng)基。作用48 h后,用棉簽刮下保留在膜上表面的細(xì)胞,甲醇∶冰乙酸(3∶1)固定30 min,吉姆薩染色15 min,清洗,晾干,倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。每組3個(gè)小室,每個(gè)小室選10個(gè)視野計(jì)數(shù)。
1.8AO/EB凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(PC3)1×105個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中,爬片處理,分別取2.0 mg/ml,4.0 mg/ml為實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)為對(duì)照組,每組分別鋪3個(gè)復(fù)孔,37℃培養(yǎng),細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí),應(yīng)用AO/EB試劑盒觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,激光共聚焦顯微鏡觀察。AO/EB 測(cè)細(xì)胞凋亡,AO與核內(nèi)DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色熒光,可以透過(guò)完整的膜。EB與核內(nèi)DNA結(jié)合呈現(xiàn)橘紅色熒光,不能透過(guò)完整核膜。凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光加強(qiáng),形態(tài)皺縮成塊狀或圓珠狀。
1.9檢測(cè)細(xì)胞中Integrin(ITG)β1、ITG連接激酶(ILK)、纖維型肌動(dòng)蛋白(F-actin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3 mRNA相對(duì)表達(dá)量 PC3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),90%融合度時(shí)加入不同劑量組藥物作用。48 h后加入TRIzol裂解細(xì)胞收集裂解液,提取總RNA,PCR反轉(zhuǎn)錄,qPCR均使用生工試劑盒構(gòu)建,按說(shuō)明書(shū)完成,所用引物為GAPDH正義鏈:5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反義鏈:5′AGGGG CCATCCACAGTCTTC-3′。ITGβ1正義鏈:5′-ACCTG CCTTGGTGTCTGTG-3′,反義鏈:5′-CAACTTCTCCC TGCTTTCCA-3′。ILK正義鏈:5′-GACGAAGCTCA ACGAGAA-3′,反義鏈:5′-AGTCCCTGCTCTTCCTTGT-3′。F-actin正義鏈:5′-CTCCATCCTGGCCTC GCTGT-3′,反義鏈:5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。Caspase3正義鏈:5′-ACTGGAAAGCCGAAACTC TTCATCA-3′,反義鏈:5′-GGAAGTCGGCCTCCACTGGTATC-3′。
1.10免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn) 蛋白制備:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(PC3)1×105個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度接近90%時(shí),加藥。分別取2.0、4.0 mg/ml為實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)為對(duì)照組,每組分別鋪3個(gè)復(fù)孔,37℃培養(yǎng),48 h后提蛋白。沸水使其變性,-80℃保存。WB:蛋白樣品上樣-電泳-轉(zhuǎn)膜-5%的血清白蛋白(BSA)封閉-封一抗(ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3)分別1∶1 000配比,4℃搖動(dòng)過(guò)夜。次日,洗膜-封入抗兔、抗鼠二抗,1∶4 000配比,洗膜。條帶顯色3 min,曝光時(shí)間根據(jù)蛋白的不同而有差異(5 s至5 min)。
1.11數(shù)據(jù)分析 采用Graphpad8.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
2.1ESWE對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 不同濃度的ESWE對(duì)PC3細(xì)胞具有比較明顯的抑制作用,2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/ml的抑制率分別為(7.58±2.60)%、(20.92±5.40)%、(42.55±12.60)%、(68.47±4.80)%、(86.47±1.79)%、(90.15±1.11)%。其中對(duì)PC3的IC50值為6.265 mg/ml。
2.2ESWE對(duì)PC3細(xì)胞遷移能力的影響 與0 h對(duì)比,作用48 h后對(duì)照組遷移率為93.6%±2.3%,2.0、4.0 mg/ml組遷移率分別為70.2%±2.0%、60.6%±1.8%,見(jiàn)圖1,隨著藥物濃度的增加遷移率逐漸降低。
圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)作用不同時(shí)間PC3細(xì)胞遷移能力(×50)
2.3ESWE對(duì)PC3細(xì)胞侵襲能力的影響 用生長(zhǎng)48 h的PC3細(xì)胞通過(guò)transwell小室的數(shù)目來(lái)計(jì)算細(xì)胞的侵襲能力,對(duì)照組侵襲數(shù)為(107.6±2.0)個(gè),2.0、4.0 mg/ml組分別為(70.8±1.6)個(gè)、(42.8±1.5)個(gè),隨藥物濃度的升高侵襲能力逐漸減弱(P<0.01)。見(jiàn)圖2。
圖2 transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC3細(xì)胞株侵襲能力(吉姆薩染色,×100)
2.4ESWE對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組細(xì)胞核呈規(guī)則形態(tài),未見(jiàn)凋亡現(xiàn)象。2.0 mg/ml組細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的皺縮現(xiàn)象,呈早期凋亡的現(xiàn)象。4.0 mg/ml組多個(gè)細(xì)胞核呈現(xiàn)皺縮、塊狀,呈晚期凋亡現(xiàn)象,見(jiàn)圖3。藥物可促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡,并呈劑量依賴。
2.5ESWE對(duì)PC3細(xì)胞 ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3 mRNA表達(dá)的影響 隨著ESWE濃度的增加ITGβ1 mRNA表達(dá)量4.0mg/ml組顯著低于2.0 mg/ml組,2.0、4.0 mg/ml組顯著低于對(duì)照組(P<0.05);ILK mRNA表達(dá)量2.0、4.0 mg/ml組低于對(duì)照組且具有顯著性差異(P<0.05),4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組無(wú)顯著差異性(P>0.05);F-actin mRNA表達(dá)量沒(méi)有明顯變化;而Caspase3 mRNA表達(dá)量2.0、4.0 mg/ml組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05),4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組不具有顯著差異性(P>0.05)。見(jiàn)表1。
箭頭所示為細(xì)胞凋亡圖3 PC3細(xì)胞凋亡(AO/EB染色,×600)
表1 ITGβ1、ILK、F-actin、Caspase3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較
2.6ESWE對(duì)PC3細(xì)胞ITGβ1、ILK、F-actin、Capase3蛋白表達(dá)的影響 隨ESWE濃度升高ITGβ1、ILK、F-actin表達(dá)量均下降,ITGβ1 2.0 mg/ml組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05),4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組、對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05);ILK 2.0 mg/ml組與對(duì)照組、4.0 mg/ml組比較具有顯著性差異(P<0.05),F(xiàn)-actin 2.0 mg/ml組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05),2.0 mg/ml組與4.0 mg/ml組比較有顯著性差異(P<0.05);Caspase3表達(dá)量隨ESWE濃度升高逐漸上升,2.0 mg/ml組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05),4.0 mg/ml組與2.0 mg/ml組比較有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)圖4,表2。
圖4 WB檢測(cè)各組ITGβ1/ILK/F-actin及Caspase3蛋白水平
表2 各組ITGβ1/ILK/F-actin及Caspase3灰度值
ESW為中國(guó)著名的食用和藥用昆蟲(chóng),用作傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)骨損傷、血瘀和免疫相關(guān)疾病的治療?,F(xiàn)代藥理研究表明ESWE可以抑制各種腫瘤的生長(zhǎng)〔6〕。本實(shí)驗(yàn)從ESW粉末中通過(guò)化學(xué)提純的方法提取醇提物〔7〕體外作用前列腺癌細(xì)胞PC3。本實(shí)驗(yàn)得出ESWE可以降低ITGβ1、ILK并上調(diào)Caspase3蛋白質(zhì)表達(dá),ESWE的抗侵襲作用是前列腺癌細(xì)胞通過(guò)ITGβ1降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分調(diào)節(jié)ILK與F-actin表達(dá),上調(diào)Caspase3表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn),這與ECM層黏連蛋白與腫瘤表面受體相互結(jié)合從而降解ECM,構(gòu)成局部溶解通道,從而降低細(xì)胞黏附性有直接聯(lián)系〔8〕。 ITGβ1介導(dǎo)細(xì)胞與ECM層黏連蛋白的黏附能力〔9〕,ITGβ1表達(dá)量高則細(xì)胞黏附性弱,反之則強(qiáng)。ITG家族本身不具有激酶的活性,與ECM結(jié)合后激活I(lǐng)LK招募Paxillin、Parvin、Plectin等與actin相結(jié)合從而啟動(dòng)ITG信號(hào)通路,調(diào)節(jié)骨架蛋白F-actin的組裝〔10〕。ILK靶向催化絲/蘇氨酸蛋白激酶(PKB/Akt),PKB磷酸化下游蛋白底物糖原合成酶激酶(GSK)-3β調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔11〕。PKB/GSK3β活化后可以減少因線粒體膜通透性改變所引起的細(xì)胞凋亡,并顯著降低Caspase3的表達(dá)及活性〔12〕。
在一些研究中已經(jīng)報(bào)道了ESW可溶性蛋白的抗腫瘤活性〔5〕,醇提物與腫瘤的抑制作用相關(guān)研究很少,其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。本研究證明ESWE通過(guò) ITGβ1/ILK/F-actin信號(hào)途徑參與前列腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲過(guò)程,在此過(guò)程中影響了微絲骨架蛋白F-actin重構(gòu),但并不影響其總量的表達(dá)。同時(shí)ILK可調(diào)節(jié)下游蛋白Caspase3促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果可為新的腫瘤治療藥物的研究提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
致謝:黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢(shì)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目提供資助!