楊天姝，高家東，戴彰言，貝錦龍，張琪，陳中健，劉軍，付華，陳光輝

外源蛋白合成抑制劑對雜交水稻種子耐貯藏能力的影響

楊天姝1,2,3，高家東2,3#，戴彰言2,3#，貝錦龍2,3，張琪2,3，陳中健2,3，劉軍2,3，付華4*，陳光輝1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，湖南 長沙 410128；2.廣東省農(nóng)作物種質資源保存與利用重點實驗室廣東 廣州 510640；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東 廣州 510640；4.廣東省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，廣東 廣州 510640)

以不耐貯藏雜交水稻II優(yōu)998種子及博優(yōu)998(對照)種子為材料，采用iTRAQ定量蛋白質組學的方法，鑒定2種不同耐貯藏能力種子貯藏前后的差異蛋白，共鑒定出5 210個蛋白，其中差異顯著的蛋白100個；II優(yōu)998種子在貯藏期間的差異蛋白數(shù)量顯著高于對照種子的差異蛋白數(shù)；通過Pathway顯著性富集的方法，確定差異蛋白參與的主要代謝途徑是Ribosome途徑；II優(yōu)998種子在自然條件貯藏期間有大量的核糖體蛋白變化差異，表明蛋白質生物合成可能與種子耐貯藏能力有關。灌漿期利用3種外源蛋白合成抑制劑(農(nóng)用鏈霉素、春雷霉素和廣譜性農(nóng)藥咪鮮胺)噴施種子，結果表明，噴施農(nóng)用鏈霉素可以提高雜交水稻種子自然條件下的耐貯藏能力。

水稻；種子；耐貯藏能力；核糖體蛋白；外源蛋白合成抑制劑；發(fā)芽率

種子是遺傳物質的載體，也是植物種質資源長期保存和物種多樣性保存的重要材料。由于種子生產(chǎn)的不確定性，常需要對種子進行短期貯藏，但水稻種子在南方高溫高濕條件下容易劣變而喪失活力，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[1-2]。

種子耐貯藏能力受遺傳、種子發(fā)育期間的環(huán)境條件及貯藏條件等因素影響[1-6]。長期以來，國內外主要通過工程技術途徑(如低溫低濕技術)解決種子安全貯藏問題，但即使使用低溫冷庫，也無法從根本上解決種子老化劣變引起的種子活力下降與壽命喪失問題[7]；因此，了解相應的調控機制，尋找更有效的調控方法，提升種子的耐貯藏能力已成為研究的熱點。

本研究中，采用iTRAQ定量蛋白質組學技術獲得差異蛋白，探索蛋白質的生物合成與雜交稻種子耐貯藏能力的關系，旨在篩選能夠有效延長雜交稻種子耐貯藏能力的外源調控產(chǎn)品。

1　材料與方法

1.1　材料

以不耐貯藏的雜交稻II優(yōu)998種子為材料，以生產(chǎn)中大面積應用的相對耐貯藏的博優(yōu)998種子為對照。2種材料均來自廣東省金稻種業(yè)有限公司。

1.2　方法

1.2.1種子胚iTRAQ定量蛋白質組學分析

首先參照GAO等[2]的方法提取種子胚蛋白質，然后開展蛋白質酶解和質譜檢測。

將保存于冰箱的蛋白質干粉溶于適量裂解緩沖液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)，200 W超聲15 min。4 ℃ 30 000離心20 min，得上清液；用Bradford試劑盒測量蛋白濃度。加入DTT，使其濃度為10 mmol/L，于37 ℃保持4 h；冷卻至室溫，加入0.55 mol/L的碘乙酰胺，使其濃度為55 mmol/L，避光反應1 h；再加入5倍體積的冷丙酮，于-20 ℃過夜，沉降蛋白，4 ℃ 8 000離心20 min；收集沉淀，干燥后，加入約50 μL TEAB溶解蛋白，超聲15 min；加入胰蛋白酶Trypsin Gold(酶與蛋白的質量比為1∶20)，37 ℃酶解，過夜。

參照YANG等[8]的方法進行iTRAQ定量蛋白質組學分析。

采用Applied Biosystems的4-plex iTRAQ分別標記酶解后的肽段，將少量標記樣品混合，用質譜儀(Thermo Orbitrap Fusion)測定肽段標記的效率。標記檢測無異常后，再將全部的標記樣品等量混合。參照說明書，通過C18SPE柱(C18Cartridge Solid Phase Extraction)去除已標記肽段混合液中的鹽離子。利用Thermo RSLC 3000儀器結合XterraMs C18柱(3.5 μm, 2.1 mm×150 mm, Waters)對混合后的肽段進行預分離，分級為12個組分。對每個組分進行液相串聯(lián)質譜(LC?MS/MS)分析，基本條件如下：高效液相色譜儀，Thermo Scientific RSLC Nano 3000；富集柱，ThermoPepMap u-precolumn(5 μm, 300 μm×5 mm)；分析柱，PepMap C18反相納升柱(3 μm, 75 μm×150 mm, Dionex)；主要有機相梯度，4%～90%乙腈(含0.1%甲酸)洗脫135 min；流速，300 nL/min；上樣量，1 μg；質譜儀，ThermoOrbitrap Fusion；噴霧電壓，1.9 kV；離子傳輸管溫度，275 ℃；掃描模式，正離子；碰撞能量，40% HCD；分辨率設置，一級120 000(/200)，二級30 000(/200)；母離子掃描范圍：/350～1550；子離子掃描范圍，自動。對質譜下機的原始文件進行峰識別，得到峰列表。利用蛋白質數(shù)據(jù)庫檢索軟件MASCOT進行肽段及蛋白質的鑒定，比較各蛋白在各樣品之間相對含量的關系，從而獲得一些重要的蛋白。

樣品編號：貯藏前博優(yōu)998種子用S1表示，貯藏后博優(yōu)998種子用S2表示；貯藏前Ⅱ優(yōu)998種子用S3表示，貯藏后Ⅱ優(yōu)998種子用S4表示。每個樣本3次重復。

1.2.2田間制種及種子壽命調控劑處理

參照吳玉坤等[9]的方法進行田間制種，灌漿期適時噴施多效唑。在種子收獲前12 d或噴施“九二〇”后7 d，分別噴施外源蛋白質合成抑制劑農(nóng)用鏈霉素、春雷霉素和廣譜性農(nóng)藥咪鮮胺等調控劑。以噴施清水為對照。

1.2.3種子人工老化處理

參照劉軍等[10]和CHEN等[11]的方法進行種子人工老化處理。

老化處理前準備3個密封的干燥器，其中1個加入過飽和MgCl2溶液，置于20 ℃人工氣候箱或者烘箱，其余2個各加入過飽和的KCl溶液，分別置于25 ℃和40 ℃人工氣候箱或者烘箱。將收獲的水稻種子分別裝于網(wǎng)袋，放于密封干燥器(加入過飽和的KCl溶液，25 ℃，相對濕度85%)，預處理3 d；轉移至已經(jīng)平衡好的干燥器中(加入過飽和的KCl溶液，40 ℃，相對濕度83%)處理8 d；再置于干燥器(加入過飽和MgCl2溶液，20 ℃，相對濕度33%)干燥3 d，密封，貯藏于-20 ℃的冰箱，備用。

1.2.4種子自然老化處理

參照GAO等[2]的方法，將收獲的水稻種子分別用網(wǎng)袋裝好，于自然條件貯藏2年后取樣，測定發(fā)芽率。

1.2.5種子發(fā)芽率的測定

稱取干燥后的種子，每個處理15 g，充分吸水12 h。倒掉多余水分后，將種子置于底部墊有2層發(fā)芽紙的發(fā)芽皿中進行萌發(fā)(每盒發(fā)芽皿100粒)。萌發(fā)時采用15 000 lx光照培養(yǎng)箱(12 h光照，12 h黑暗)，保持發(fā)芽紙濕潤且無積水。統(tǒng)計萌發(fā)7 d的發(fā)芽率。3次重復。

1.3　數(shù)據(jù)處理

采用Perseus軟件進行差異蛋白數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析[12]。根據(jù)蛋白豐度差異顯著性篩選出不同類型的差異蛋白，當?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達到2倍以上，且＜0.05時，視為差異蛋白。

運用KOBAS 2.0進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路(pathway)富集分析[13]。以所有鑒定到的蛋白為背景，對不同類型的差異蛋白進行KEGG富集度分析，采用KOBAS的富集模塊計算不同KEGG通路的富集情況。

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理與分析；運用Sigma Plot繪圖。

2　結果與分析

2.1　不同種子貯藏前后的差異蛋白質鑒定

利用MASCOT共鑒定出二級譜圖545 722個，特有肽段序列74 651個，5 210個蛋白質(表1)。使用Perseus軟件進行統(tǒng)計分析，共鑒定出100個差異表達蛋白質(DEP)。其中，不同比較方案的平均差異蛋白分別為19、29.75、23和28.33種(表2)。從表2可以看出，Ⅱ優(yōu)998貯藏前后(S3與S4)2倍差異以上的蛋白平均為28.33個(4個下調，24.33個上調)；對照博優(yōu)998貯藏前后(S1與S2)2倍差異以上的蛋白19個(平均7.67個上調，11.33個下調)。不同耐貯藏能力種子貯藏前后的差異蛋白質變化較大。貯藏前S1與S3的差異蛋白為29.75個，其中S3中豐度高的差異蛋白質僅有2.75個，而對照S1中豐度高的差異蛋白較多，為27個。貯藏后比較S2與S4，與貯藏前的結果相反，不耐貯藏的II優(yōu)998老化種子中豐度高的差異蛋白為19.33個，多于S2中的。

表1　不同水稻種子貯藏前后蛋白質組iTRAQ鑒定結果

表2　差異蛋白數(shù)量統(tǒng)計

表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值。

2.2　不同種子貯藏后的差異蛋白質比較

采用KEGG通路(Pathway)顯著性富集分析上述差異表達蛋白參與的最主要代謝途徑和信號轉導途徑。在所有的比較類型中，3種比較(S1與S3、S2與S4、S3與S4)都僅有1條通路具有統(tǒng)計學意義，且均為Ribosome途徑，而S1與S2的比較也是Ribosome途徑排名第一。

表3列出了Ⅱ優(yōu)998種子在貯藏前后(S3與S4)出現(xiàn)的代表性差異蛋白。從表3可以看出，在II優(yōu)998種子中，豐度較高的蛋白絕大部分是核糖體蛋白，而這些核糖體蛋白的絕大部分(87%)是貯藏后種子 (S4)中豐度高的差異蛋白。說明Ⅱ優(yōu)998種子在自然老化過程中大量的核糖體蛋白豐度上調，有較多的蛋白質合成代謝。

表3　Ⅱ優(yōu)998種子在貯藏前后出現(xiàn)的代表性差異蛋白

2.3　灌漿期外源調控劑對人工老化種子發(fā)芽率的影響

從圖1可以看出，種子入庫時，不同外源調控劑處理的種子發(fā)芽率都為96%左右，處理與對照無顯著差異，表明各調控劑處理對種子初始發(fā)芽率的影響不明顯。

人工老化8 d后，外源蛋白質合成抑制劑春雷霉素處理的種子發(fā)芽率可達80%，顯著高于對照的發(fā)芽率，比對照的高5.65%，表明春雷霉素能夠提高種子人工老化后的出芽能力。與對照相比，農(nóng)用鏈霉素處理的發(fā)芽率略有增加，咪酰胺處理的發(fā)芽率有所下降，但均與對照無顯著差異。

圖1　不同處理種子人工老化前后的發(fā)芽率

2.4　灌漿期外源調控劑處理對自然老化種子發(fā)芽率的影響

從圖2可以看出，自然貯藏2年后，農(nóng)用鏈霉素處理的種子的發(fā)芽率(76.25%)極顯著高于對照處理的(66.79%)；春雷霉素處理的種子發(fā)芽率與對照無顯著差異；咪酰胺處理的種子的發(fā)芽率僅為43.50%，極顯著低于對照種子的發(fā)芽率。表明農(nóng)用鏈霉素處理可以有效提高種子的耐貯藏能力。

圖2　不同處理種子自然老化前后的發(fā)芽率

3　結論與討論

為探索水稻種子劣變過程中響應各種脅迫的調控機制，本課題組前期選取不同耐貯藏能力的雜交稻種子(用自然貯藏2年后種子發(fā)芽率衡量種子的耐貯藏能力)，利用基于雙向電泳的蛋白質組學方法對種胚的蛋白質差異進行比較，發(fā)現(xiàn)與自然貯藏老化過程種子耐貯藏有關的蛋白包括氧化還原調節(jié)蛋白(如谷氧還蛋白，乙二醛酶等)、DNA損傷修復蛋白以及Lea 蛋白等，且不耐貯藏種子在貯藏過程中的差異蛋白數(shù)量遠遠高于相對耐貯藏種子的[2]。本研究采用iTRAQ技術鑒定出5 200多個總蛋白，同樣發(fā)現(xiàn)種子自然貯藏過程中不耐貯藏種子的差異蛋白數(shù)高于耐貯藏種子中的數(shù)量，2種方法鑒定結果基本一致。

本研究中，發(fā)現(xiàn)不耐貯藏種子在貯藏過程中有核糖體蛋白的劇烈變化，表明蛋白質的生物合成可能與種子貯藏壽命有關?；诘鞍踪|翻譯合成可能與種子貯藏壽命有關的結果，推測不耐貯藏種子在老化期間可能有較多的蛋白質合成。本研究中，通過噴施外源蛋白合成抑制劑來調控水稻種子的耐貯藏能力，發(fā)現(xiàn)農(nóng)用鏈霉素能夠提高自然貯藏2年的種子的發(fā)芽率，即提高了種子的耐貯藏能力，但其作用機理還需進一步研究。

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Effects of exogenous protein synthesis inhibitors on hybrid rice seed storability

YANG Tianshu1,2,3, GAO Jiadong2,3#, DAI Zhangyan2,3#, BEI Jinglong2,3, ZHANG Qi2,3, CHEN Zhongjian2,3, LIU Jun2,3, FU Hua4*, CHEN Guanghui1*

(1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou, Guangdong 510640, China; 3.Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China; 4.Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China)

In this study, a quantitative proteomics of iTRAQ was conducted for rice seeds before and after 24-month natural storage on two hybrid rice cultivars, II You 998 with low storability and the control Boyou 998. More than 5 210 proteins were identified, of which 100 differentially expressed protein (DEP) were significant different. Interestingly, the amount of differentially expressed proteins in the storage period of the seeds with poor storability was significantly higher than that of the control seeds. Furthermore, ribosome pathway was determined to be the main metabolic pathway involved in regulation of seed storability by pathway significant enrichment. Our data showed that more ribosomal proteins were synthesized in the seeds which were not resistant to storage, suggesting that protein biosynthesis might be related to the storage tolerance of seeds. And, the germination percentages of hybrid rice seeds treated with different exogenous protein synthesis inhibitors during the filling stage significantly varied after 2 years storage under natural conditions. Our study showed that treatment of agro-streptomycin, during the filling stage could effectively enhance rice seed storability under natural storage conditions.

; seed; storability; ribosomal protein; exogenous protein synthesis inhibitors; germination percentage

S511.093

A

1007-1032(2020)05-0501-06

楊天姝，高家東，戴彰言，貝錦龍，張琪，陳中健，劉軍，付華，陳光輝．外源蛋白合成抑制劑對雜交水稻種子耐貯藏能力的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(5)：501-506．

YANG T S, GAO J D, DAI Z Y, BEI J L, ZHANG Q, CHEN Z J, LIU J, FU H, CHEN G H. Effects of exogenous protein synthesis inhibitors on hybrid rice seed storability[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 501-506.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-04

2019-12-23

國家自然科學基金項目(31871716、31371715)；廣東省科技項目(2018B020202004、2019KJ106)；廣州市科技項目(201909020001、201807010114)

楊天姝(1993—)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，主要從事種子科學與技術研究，1290989730@qq.com；#共同第一作者，高家東(1977—)，男，湖南永州人，助理研究員，主要從事種子生物學研究，gaogao126@139.com；#共同第一作者，戴彰言(1985—)，男，廣東廣州人，助理研究員，主要從事生物信息學研究，daizhangyan@agrogene.ac.cn；*通信作者，付華，副研究員，主要從事水稻分子育種研究，13825164071@139.com；*通信作者，陳光輝，博士，教授，主要從事種子科學與技術研究，cgh68@163.com

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正