孫璘 王成成 李國英 李番 焦瑞蓮 任毓忠

摘要：對出現(xiàn)維管束變色、植株矮化且葉片變黃的秋葵植株莖稈應(yīng)用組織分離法進(jìn)行分離、純化，獲得單孢菌株。用孢子懸浮液接種水培秋葵幼苗進(jìn)行致病性測定，并通過形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)對病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，供試秋葵菌株的菌落特征，分生孢子、分生孢子梗和微菌核形態(tài)均與大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）一致;經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，供試菌株的ITS-ACT基因序列與大麗輪枝菌（V.dahliae，登錄號：HQ206859和HQ206856，HQ206975和HQ206966）相似性達(dá)99.5%以上。因此，將引起石河子地區(qū)秋葵黃萎病的病原菌鑒定為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae），且非落葉型和落葉型菌系均能侵染秋葵。

關(guān)鍵詞：秋葵;黃萎病;多基因聯(lián)合;病原鑒定;石河子

中圖分類號：S649? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2020）08-0022-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.08.006

Abstract：The stems of okra plants with discolored vascular bundles， dwarfized plants and yellowing leaves were isolated and purified by tissue separation to obtain monospora strains. Pathogenicity of isolations was tested with spore suspension inoculating water culture okra seedling， and the pathogen was identified based on morphological characteristics and sequence analysis of rDNA-ITS region and actin gene. The results showed that the colony morphology， conidia， conidiophore and microsclerotium of the strains were consistent with Verticillium dahliae. The ITS-ACT gene sequence of the tested strains showed 99.5% sequence similarity with V.dahliae（accession numbers：HQ206859 and HQ206856， HQ206975 and HQ206966）. Therefore， the pathogen of Verticillium Wilt of Okra was identified as Verticillium dahliae， non-deciduous and deciduous type strains can infect okra in Shihezi area.

Key words：Okra;Verticillium wilt;Polygenic association;Pathogen identification;Shihezi

秋葵是一種錦葵科（Malvaceae）植物，富含維生素、礦物質(zhì)以及蛋白質(zhì)。種子含有大量的鐵、錳、鉀等元素，可提取蛋白質(zhì)和油脂，榨油食用。秋葵嫩果具有大量維生素，是一種高檔綠色蔬菜。經(jīng)常食用秋葵有助于滋陰補(bǔ)陽，健腸胃[1 - 4 ]。由于秋葵的食用價(jià)值很高，全國各地都開始大量種植和引種，但隨著種植區(qū)域和種植面積的不斷擴(kuò)張，秋葵病害發(fā)生日益嚴(yán)重。2017年，石河子部分區(qū)域種植的秋葵全株系統(tǒng)性發(fā)病，下部葉片顯癥后再向中上部葉片發(fā)展，葉肉變黃后整片萎蔫干枯。剖開植株莖稈，發(fā)現(xiàn)維管束明顯變色，嚴(yán)重時(shí)會造成植株枯死。關(guān)于秋葵黃萎病，早在1918年Carpenter等[5 ]對發(fā)生癥狀進(jìn)行了描述。1997年在我國也進(jìn)行了發(fā)病規(guī)律和防治方法的系統(tǒng)研究[6 ]。為準(zhǔn)確鑒定病原菌種類，我們以形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定為切入點(diǎn)，以期鑒定該病的病原菌及其致病類型，為病害防治提供參考依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?病樣采集及分離純化

2017、2018年病害發(fā)生期的7 — 8月，于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站、石河子總場等地采集發(fā)病明顯的病株。將病株莖稈表皮剝離后切成長0.5 cm的小段，用1 g/kg的升汞溶液浸泡30 s，再用無菌水沖洗3次，置無菌濾紙上吸干多余液體。如為新鮮采集的病樣，莖稈表面用75%酒精消毒后剝?nèi)ケ砥?，用滅菌剪刀直接將莖稈剪成長0.5 cm的小段。將病樣莖稈置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。當(dāng)其長出白色菌絲時(shí)按照常規(guī)方法進(jìn)行單孢純化[7 ]。菌株置于PDA斜面保存于4 ℃冰箱。

1.2? ?致病性測定

1.2.1? ? 水培苗準(zhǔn)備? ? 致病性測定采用水培苗孢子懸浮液接種法。將市購秋葵種子用75%酒精浸泡消毒10 min，用無菌水沖洗干凈后播種在滅菌鋸末中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽，幼苗真葉展平后拔出轉(zhuǎn)移至水培盒中，將水培盒加水放入25 ℃光照培養(yǎng)箱光暗12 h交替培育。幼苗露出真葉后，將培養(yǎng)盒中的水換為青島海博生物有限公司生產(chǎn)的MS營養(yǎng)液（不含瓊脂和蔗糖），繼續(xù)培育待用。

1.2.2? ? 孢子懸浮液制備及接種? ? 將供試菌株在PDA平板上活化后接入察氏（Czapek）液體培養(yǎng)基中，25 ℃、3.33 r/s振蕩培養(yǎng)7 d左右，雙層紗布過濾，收集紗布上的菌絲用作基因組DNA提取，濾液用作配制致病性測定孢子懸浮液。濾液經(jīng)133.33 r/s離心沉淀后，用無菌水配制成濃度1×107 CFU/mL的孢子懸浮液。待秋葵幼苗水培至2片真葉后，對根部用配制好的孢子懸浮液浸泡接種12 h后倒掉孢子懸浮液，將幼苗重新放入水培液中培養(yǎng)。每個菌株接種3盒幼苗（每盒12株），用無菌水培做對照。10 d后調(diào)查發(fā)病情況，每隔3 d調(diào)查1次，40 d后結(jié)束，對病株重新進(jìn)行病菌分離。

1.3? ?病原鑒定

1.3.1? ? 形態(tài)學(xué)鑒定? ? 供試菌株活化后接種于PDA平板，25 ℃培養(yǎng)7 d后在菌落邊緣傾斜插入滅菌蓋玻片4～5片，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d后記錄各菌株在PDA平板上菌落形態(tài)及微菌核產(chǎn)生情況，觀察和測量分生孢子、分生孢子梗和微菌核的形態(tài)、大小及產(chǎn)生方式等[8 ]。

1.3.2? ? 分子生物學(xué)的鑒定? ? 選取3個供試菌株，分別收集其菌絲后用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，選用真核生物rDNA通用引物ITS1/ITS4、肌動蛋白引物ACT-512F/ACT-783R（引物序列見表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)展，反應(yīng)體系及條件參照岳永亮[9 ]的方法進(jìn)行。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將所測得的序列進(jìn)行BLAST比對，查找Gen Bank已登錄的相似序列來進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3? ? 病菌不同致病類型檢測? ? 用V. dahliae落葉型特異性引物INTD2f/INTD2r[10 ]和非落葉型引物INTND2f/INTND2r[11 ]（引物序列見表1）對供試菌株進(jìn)行致病類型檢測，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件參照魏春芝[12 ]。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?田間癥狀

在石河子地區(qū)，秋葵黃萎病多在7月上中旬出現(xiàn)癥狀，八月上旬發(fā)病最為明顯。癥狀先從下部葉片開始，逐漸向上擴(kuò)展。發(fā)病初期，葉脈周圍的葉肉組織逐漸失綠變黃，附近主脈變褐色，后周圍支脈也隨之變褐，變褐葉脈在葉片上形成褐色樹枝狀（圖1 A）。部分葉片表現(xiàn)為葉緣出現(xiàn)褪綠，后形成壞死斑。進(jìn)一步擴(kuò)展后，發(fā)病葉片整個逐漸變黃，邊緣上卷（圖1 B），干枯脫落，嚴(yán)重時(shí)整個植株落成光桿，植株干枯死亡（圖1 C）。剖開發(fā)病植株莖稈，維管束組織變褐，甚至整個髓部變褐（圖1 D），造成秋葵不能結(jié)實(shí)甚至大面積枯死。

2.2? ?致病性測定

接種后20 d左右，幼苗植株自下而上開始出現(xiàn)癥狀，即接種株先自下部葉片開始主脈逐漸褪綠變黃，周圍葉肉隨之褪綠，邊界不明顯（圖1E）。隨后病斑快速擴(kuò)展，致整個葉片卷曲并迅速枯死，整株萎蔫死亡（圖1 F）。剖開病株的莖稈，維管束明顯變褐（圖1H），與田間病害的癥狀表現(xiàn)基本一致。對照植株生長健壯（圖1G），維管束也無明顯變色現(xiàn)象（圖1I）。對發(fā)病植株進(jìn)行再分離，所得菌落特征與供試菌株表現(xiàn)一致。

2.3? ?形態(tài)學(xué)鑒別

供試菌株在PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）上的菌落近圓形，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落外緣為白色透明的菌絲，中心有黑色的微菌核產(chǎn)生（圖2 A）。經(jīng)顯微觀察，菌株分生孢子梗多為1個頂枝小梗和1～3層輪生小梗，每層有2～4個分枝（圖2 B）。頂枝小梗長度26.3～77.7 μm（平均49.9 μm），輪枝小梗長度15.7～52.1 μm（平均26.23 μm），輪層間距33.1～47.3 μm（平均43.6 μm）。分生孢子卵形、橢圓形，無色透明，大小為（4.4～8.0） μm×（2.1～4.1） μm。微菌核念珠狀、長橢圓形，或近球形，形態(tài)大小差異較大，一般35.1 m～108.9? μm（平均60.9 μm）×（25.5～82.7） μm（平均35.3 μm）（圖2 C）。供試菌株的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征與文獻(xiàn)報(bào)道的大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）一致。

2.4? ?分子生物學(xué)鑒定

選取菌株XJok1、XJok3、XJok4，應(yīng)用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行rDNA-ITS PCR擴(kuò)增，獲得大小為540 bp的DNA片段。利用NCBI進(jìn)行Blast同源性比對，供試的3個菌株ITS區(qū)序列與來自西班牙棉花和美國茄子上的V. dahliae（登錄號HQ206859和HQ206856）序列同源性達(dá)99.81%。供試3個菌株肌動蛋白基因（ACT-512F/ACT-783R）PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為200 bp左右，與來自上述寄主同一分離物序列（登錄號HQ206975和HQ206966）的同源性99.5%以上。將以上2個基因聯(lián)合建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，供試菌株分別與來自中國棉花、美國茄子、韓國馬鈴薯、匈牙利臭椿以及中國蘿卜上的大麗輪枝菌（V. dahliae）分離物處于同一個分支上，與輪枝菌屬（Verticillium）的其他種的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。結(jié)合病菌形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起石河子地區(qū)秋葵黃萎病的病原確定為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）（圖3）。

2.5? ?病菌致病類型的檢測

用大麗輪枝菌（V. dahliae）落葉型特異性引物INTD2f/INTD2r和非落葉型引物INTND2f/INTND2r對供試菌株進(jìn)行致病類型檢測的結(jié)果（圖4）顯示，供試菌株XJok1和XJok4利用落葉型特異性引物擴(kuò)增出462 bp目標(biāo)條帶，而利用非落葉型特異性引物，菌株XJok2和XJok3擴(kuò)增出約824 bp目標(biāo)條帶，陰性對照都沒有條帶出現(xiàn)。表明在石河子地區(qū)，大麗輪枝菌落葉型菌株和非落葉性型菌株均可引起秋葵黃萎病。

3? ?小結(jié)與討論

經(jīng)田間觀察，秋葵黃萎病癥狀表現(xiàn)為葉肉組織首先失綠壞死，后周圍支脈變褐，呈典型的“花西瓜皮狀”，嚴(yán)重時(shí)葉片干枯脫落甚至整株死亡。病株維管束組織變褐，甚至整個髓部變褐。經(jīng)分離純化鑒定，病菌分生孢子梗多為1個頂枝小梗和1～3層輪生小梗，每層有2～4個分枝，輪層間距33.1～47.3 μm（平均43.6 μm）。分生孢子單胞、卵形或橢圓形，無色透明，大小為（4.4～8）μm×（2.1～4.1） μm。產(chǎn)生的微菌核黑色，念珠狀、長橢圓形或近球形，（35.1～108.9）μm（平均60.9 μm）×（25.5～82.7） μm（平均35.3 μm）。供試菌株ITS區(qū)和與肌動蛋白基因（ACT）序列與已報(bào)道的大麗輪枝菌（V. dahliae）同源性均高于99.5%。通過落葉型和非落葉型特異性引物PCR檢測表明，菌株XJok1和XJok4為落葉型黃萎病菌，XJok2和XJok3為非落葉型黃萎病菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與ITS-ACT建立的多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定引起新疆秋葵黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌（V. dahliae），且落葉型和非落葉型菌系都能感染秋葵。秋葵黃萎病的發(fā)生，主要與新疆棉花黃萎病土壤傳病存在密切相關(guān)，應(yīng)盡量避開棉花或茄子前茬，以減少黃萎病的發(fā)生和危害。

大麗輪枝菌（V. dahliae）是一種致病力強(qiáng)、變異性大而快的土傳維管束真菌病害。到目前為止，由大麗輪枝菌引起的各種植物黃萎病已被多個國家報(bào)道，在中國主要危害棉花、茄子、大白菜、馬鈴薯等[13 - 15 ]。新疆秋葵黃萎病的來源主要與棉花黃萎病的普遍發(fā)生有關(guān)。我們在博樂、阿拉爾等地所見，秋葵黃萎病均發(fā)生在棉花黃萎病的重病田，且新疆棉花黃萎病的主要病原也是大麗輪枝菌（V. dahliae），病田土壤中的微菌核也是侵染秋葵的主要侵染來源。

由大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病是新疆棉花上危害最嚴(yán)重的病害之一。另外，該病原菌還可以侵染綠豆、紅花、榆樹和苘麻等多種植物[16 ]。由于大麗輪枝菌基因組中存在大量的轉(zhuǎn)座子以及基因重組現(xiàn)象，導(dǎo)致其產(chǎn)生不同的生理小種，使之對寄主產(chǎn)生抗性[17 - 18 ]。我們通過分子生物學(xué)鑒定出落葉型黃萎病和非落葉型黃萎病，這一結(jié)果同樣表明黃萎病原菌中存在著不同的致病類型。關(guān)于黃萎病的防治，生產(chǎn)上主要以抗病品種的選育和種植為主，農(nóng)藝措施主要是以改茬輪作、加強(qiáng)田間管理為主。

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（本文責(zé)編：陳? ? 偉）