謝姝鴿 韓秋漪 張善端

復(fù)旦大學(xué)電光源研究所 （上海 200433）

0 紫外滅活機(jī)理

紫外光（UV）按照波長(zhǎng)范圍可以分為UVA （315 ～400 nm）、UVB （280 ～315 nm）、UVC （200 ～280 nm）和真空紫外VUV （100 ～200 nm）四段，其中在殺菌消毒中使用最多、滅活作用最強(qiáng)的是UVC 波段。紫外線殺菌消毒的主要機(jī)理是它能對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)（核糖核酸RNA 和脫氧核糖核酸DNA）產(chǎn)生光化學(xué)傷害。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)核酸被紫外線照射時(shí)會(huì)大量吸收紫外線，促使細(xì)胞體內(nèi)合成大量的間二氮雜苯（主要構(gòu)成為蛋白酶）及其異構(gòu)體，從而破壞其中的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而阻礙遺傳物質(zhì)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的合成，使微生物死亡[1]。

相比其他消毒方法，紫外消毒屬于純物理消毒，具有簡(jiǎn)單便捷、廣譜高效、無(wú)二次污染、便于管理和實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[2]。隨著各種新型紫外光源的推出，紫外消毒廣泛應(yīng)用于表面、空氣、水體和食品的殺菌消毒，還可用于有害氣體分解和螨蟲(chóng)殺滅，逐漸成為主流消毒方法之一[3]。

1 紫外滅活效果的影響因素

1.1 微生物的種類

微生物種類不同，對(duì)應(yīng)的紫外線最大吸收值也不同。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的最大吸收波長(zhǎng)為265 nm，而隱孢子菌和噬菌體的最大吸收波長(zhǎng)則分別為261 nm 和271 nm，因此對(duì)應(yīng)的滅活時(shí)間也不相同。例如，當(dāng)?shù)蛪汗療舭l(fā)出的254 nm 紫外輻照度為30 mW/cm2時(shí)，殺滅病毒、霉菌孢子、藻類細(xì)菌所需時(shí)間分別為0.1 ～1.0 s、1.0 ～8.0 s、5.0 ～40.0 s[4]。

另外，不同微生物對(duì)紫外線的敏感度也存在差異，紫外滅活的效率依次為原蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒，即紫外線對(duì)病毒尤其是腺病毒和輪狀病毒的殺滅效果最差[5]。董小平等[6]發(fā)現(xiàn)，殺滅 1×104 個(gè)/mL 的SARS 病毒和腺病毒，所需UVC 紫外劑量分別為162 mJ/cm2和200 mJ/cm2。

1.2 紫外劑量

紫外劑量在消毒過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。這里的紫外劑量是指達(dá)到一定程度的微生物滅活率時(shí)，對(duì)應(yīng)的特定波長(zhǎng)紫外線（一般是指254 nm UVC）的劑量，等于紫外輻照度與輻照時(shí)間的乘積[7]。在紫外劑量相同時(shí)，不同的輻照模式對(duì)應(yīng)的滅活效果一般也是不同的，實(shí)際應(yīng)用中常通過(guò)選擇高強(qiáng)度、短時(shí)間或者低強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)不同的消毒目標(biāo)。理論上，滅活效果和紫外劑量成正比。在完全滅活之前，劑量越大，滅活率越高[8]。需要說(shuō)明的是，在實(shí)驗(yàn)中，通常用輻照前后微生物濃度比值的對(duì)數(shù)值lg（N/N0）來(lái)表示滅活率，其中N0為初始濃度，N 為輻照一定時(shí)間后的存活濃度。具體來(lái)說(shuō)，Lg-1 對(duì)應(yīng)滅活率為90%，Lg-2 對(duì)應(yīng)滅活率為99%，Lg-3 對(duì)應(yīng)滅活率為99.9%，Lg-4 對(duì)應(yīng)滅活率為99.99%[9]。在不同的環(huán)境中，完全滅活的標(biāo)準(zhǔn)不同，對(duì)應(yīng)的紫外劑量也不同。

1.3 紫外劑量與微生物光復(fù)活的關(guān)系

當(dāng)紫外劑量充足時(shí)，微生物能夠被徹底滅活。但在劑量不足的情況下，有很多被紫外輻照失活卻未被徹底殺滅的微生物可憑借光的協(xié)助作用修復(fù)自身被破壞的結(jié)構(gòu)。微生物在受到紫外線的照射時(shí)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均會(huì)受到損傷以致死亡，但所有生物對(duì)這種光傷害都有一定的修復(fù)能力，這也是紫外消毒的主要缺點(diǎn)所在。微生物被紫外輻照后造成的損傷能被特定波長(zhǎng)光修復(fù)的現(xiàn)象稱為光復(fù)活[10]，其中的機(jī)制是經(jīng)特定波長(zhǎng)（一般指330 ～480 nm）照射后，遺傳物質(zhì)DNA 分子中的嘧啶二聚體，在無(wú)光照條件下會(huì)和一種光激活酶結(jié)合，這種酶可以在獲得光能后被激活，并使紫外輻照合成的二聚體重新分解成單體。與此同時(shí)，光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來(lái)，后續(xù)可以繼續(xù)重新執(zhí)行修復(fù)功能[11]。修復(fù)情況由微生物的種類和被紫外輻照滅活的程度決定，輻照的紫外劑量越高，修復(fù)間隔時(shí)間越長(zhǎng)，修復(fù)能力越弱[12]。

2 紫外滅活劑量研究現(xiàn)狀

閆巖等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了水中殺滅不同微生物所需的紫外劑量，如圖1 所示。從圖1 可知，殺滅腸桿菌和螺旋桿菌所需的紫外劑量較小，殺滅孢子所需的紫外劑量較大。

圖1 滅活不同微生物所需紫外劑量[13]

根據(jù)圖1 整理出不同微生物不同滅活率對(duì)應(yīng)的紫外劑量見(jiàn)表1?？梢缘玫剑和耆珳缁睿ù螅┠c桿菌大約需要紫外劑量10 ～20 mJ/cm2，而螺旋桿菌和孢子則需要39 mJ/cm2和73 mJ/cm2左右的紫外劑量。這意味著在相同的輻照強(qiáng)度下，完全滅活螺旋桿菌和孢子所需的輻照時(shí)間大約是大腸桿菌的2 ～4 倍。

表1 不同微生物不同滅活率對(duì)應(yīng)的紫外劑量[13]

馮娜[14]通過(guò)紫外線殺菌動(dòng)力學(xué)得出lg（N/N0）=-kIt=-kD，其中N0為初始微生物濃度，N 為紫外輻照后的微生物濃度，I 為紫外強(qiáng)度，t 為輻照時(shí)間，D 為紫外劑量，即紫外線對(duì)微生物的殺滅效果與紫外劑量呈指數(shù)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中，一般規(guī)定病毒殺滅率達(dá)99.999%（1g-5）時(shí)可看作完全殺滅，細(xì)菌殺滅率達(dá)99.9% （1g-3）時(shí)可看作完全殺滅，由此得出的不同微生物殺滅對(duì)應(yīng)殺滅所需的紫外劑量[15]見(jiàn)表2。

表2 不同微生物被殺滅所需的紫外劑量[15]

李夢(mèng)凱等[16]通過(guò)生物劑量法[17]得到幾種典型的微生物達(dá)到不同滅活率時(shí)所對(duì)應(yīng)的紫外劑量。首先，在實(shí)驗(yàn)室采用準(zhǔn)平行紫外光束裝置測(cè)定受試微生物的劑量響應(yīng)關(guān)系曲線；然后，將固定濃度的微生物溶液根據(jù)運(yùn)行狀況依次流經(jīng)消毒系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)定各組微生物的滅活率來(lái)對(duì)紫外消毒系統(tǒng)的滅活參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證；最后，將實(shí)際消毒系統(tǒng)的殺滅結(jié)果與劑量響應(yīng)曲線進(jìn)行比對(duì)，從而得到消毒系統(tǒng)相應(yīng)的紫外劑量，該劑量即為達(dá)到各等級(jí)滅活率的等效劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，在相同滅活率下，枯草芽孢桿菌所需紫外劑量遠(yuǎn)大于大腸桿菌和T1、T7 噬菌體。

表3 幾種典型的受試微生物達(dá)到相應(yīng)滅活率所需要的紫外劑量[16]

朱紅[15]主要研究了紫外滅活對(duì)真菌和細(xì)菌影響的差異性。正常情況下，滅活真菌的難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)菌，這主要是二者細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致的。具體來(lái)說(shuō)，有三個(gè)方面：（1）真菌的細(xì)胞核外有核膜包裹，對(duì)真菌的遺傳物質(zhì)有更好的保護(hù)作用，這增加了紫外輻照破壞真菌DNA 的難度；（2）真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)，而細(xì)菌是肽聚糖，二者成分差異使得真菌細(xì)胞對(duì)紫外耐受性更強(qiáng)；（3）細(xì)胞器組成也是不同的，真菌除核糖體外，還有高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等多種細(xì)胞器，細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜得多，所以其抗紫外輻照能力更強(qiáng)。除細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異以外，二者細(xì)胞尺寸也不同。細(xì)菌大小一般為0.5 ～5 μm，而真菌一般為10 ～100 μm，真菌體積遠(yuǎn)大于細(xì)菌，使得紫外穿透路徑更長(zhǎng)，完全滅活所需紫外劑量更大。最后，真菌相比細(xì)菌容易成團(tuán)，紫外輻照難以穿透真菌團(tuán)塊后對(duì)內(nèi)部進(jìn)行作用，這也是對(duì)真菌的有力保護(hù)[18]。

在實(shí)驗(yàn)中，DNA、蛋白質(zhì)、三磷酸腺苷（ATP）均可作為判斷細(xì)胞是否被滅活的成分依據(jù)。DNA 是細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，控制細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和運(yùn)作機(jī)制，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，而蛋白質(zhì)本身是細(xì)胞中含量最高的組成成分。要了解微生物的存活情況，既可以采用直觀的平板計(jì)數(shù)法，也可以通過(guò)檢測(cè)其DNA 與蛋白質(zhì)泄漏量來(lái)確定是否破裂死亡。同時(shí)，ATP作為生命活動(dòng)的能量物質(zhì)，其濃度的高低也可以作為微生物是否死亡的判斷依據(jù)，滅活后細(xì)胞釋放出的游離ATP 的濃度在一定程度上反應(yīng)了細(xì)胞的破壞程度。除上述的方法以外，掃描電鏡照片可更加直接地觀察到細(xì)胞表面在滅活前后的變化，還可與滅活數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行定量地比較分析[19]。滅活率隨紫外劑量變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 可見(jiàn)，四種真菌對(duì)紫外輻照的耐受性由弱到強(qiáng)依次為：木霉屬、枝頂孢屬、青霉屬、枝孢屬。同等紫外劑量下，前三者滅活率大致相同，但枝孢屬滅活率明顯較低，具體滅活數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。從圖2 可以看出，當(dāng)紫外劑量為40 mJ/cm2時(shí)，木霉屬滅活率最高，達(dá)到了98.45%，而枝頂孢屬和青霉屬的滅活率分別為93.08%和90.56%，這三者都達(dá)到了90%以上的滅活率，而枝孢屬在此紫外劑量下的滅活率僅為26.68%，顯著低于其它三種真菌。另外，對(duì)比四種真菌滅活率達(dá)到100%時(shí)所需的紫外劑量可以發(fā)現(xiàn)，木霉屬僅需50 mJ/cm2，枝頂孢屬和青霉屬則需要60 mJ/cm2和80 mJ/cm2。至于枝孢屬，100 mJ/cm2紫外劑量下的滅活率也僅為92.65%。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)大腸桿菌也進(jìn)行了紫外滅活，可以看到20 mJ/cm2的紫外劑量就能使大腸桿菌的滅活率達(dá)到100%，進(jìn)一步證明了紫外滅活真菌遠(yuǎn)比滅活細(xì)菌困難。

圖2 紫外滅活四種真菌及大腸桿菌的差異性[19]

表4 不同微生物不同滅活率對(duì)應(yīng)的紫外劑量[19]

趙琳[20]采用大腸埃希氏菌作為細(xì)菌滅活效果指示菌，研究紫外消毒的滅活效果。如圖3 所示：紫外輻射對(duì)大腸埃希氏菌有很好的滅活效果，隨著紫外劑量的增加，滅活率不斷提高，在紫外輻射劑量為15 mJ/cm2時(shí)，對(duì)數(shù)滅活率可達(dá)到4.55，即基本實(shí)現(xiàn)了完全滅活。

圖3 不同紫外輻射劑量對(duì)滅活大腸埃希氏菌的影響[20]

將圖中數(shù)據(jù)整理得到表5，從中可直觀看出，當(dāng)紫外劑量達(dá)到4 mJ/cm2以上時(shí)，99%的大腸埃希氏菌都會(huì)失去活性。

表5 大腸埃希氏菌不同滅活率對(duì)應(yīng)的紫外劑量[20]

另外，實(shí)驗(yàn)還研究了紫外輻射對(duì)核酸降解效果的影響，其中核酸降解效果仍由對(duì)數(shù)滅活率來(lái)衡量。通過(guò)測(cè)量紫外劑量分別為50 mJ/cm2、100 mJ/cm2、150 mJ/cm2、200 mJ/cm2、250 mJ/cm2、300 mJ/cm2、350 mJ/cm2、400 mJ/cm2時(shí)的定量PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），發(fā)現(xiàn)紫外輻射對(duì)核酸降解效果遠(yuǎn)差于滅活效果，這也是紫外光復(fù)活產(chǎn)生的原因。在紫外輻射劑量為400 mJ/cm2時(shí)，才可以達(dá)到Lg-3 的核酸降解率。

景明等[21]還對(duì)污水中的主要病原菌進(jìn)行了解析，主要是大腸桿菌、沙門氏菌和分枝桿菌。并研究了紫外輻射對(duì)各種病原菌的滅活效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明紫外消毒劑量為60 mJ/cm2時(shí)，大腸桿菌和沙門氏菌的滅活率可達(dá)到99.9%。相比較Ren 等[22]的紫外消毒對(duì)大腸桿菌滅活率影響的研究，當(dāng)消毒劑量為60 mJ/cm2時(shí)，大腸桿菌的滅活率可達(dá)99.99%。產(chǎn)生這種差異的原因可能是紫外消毒會(huì)受到水體中各種物質(zhì)的影響，紫外光在水中透射率下降很大。另外，相同的紫外劑量下，分枝桿菌的滅活率均不足90%，這主要與其特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，其細(xì)胞膜富含脂類，具有疏水性，從而使得分枝桿菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗性較強(qiáng)，滅活難度較大。

3 總結(jié)與展望

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，在達(dá)到相同的滅活率時(shí)，不同微生物對(duì)應(yīng)的紫外劑量存在較大差異。藻類和原生動(dòng)物所需的劑量較大，其次是霉菌孢子類。細(xì)菌和病毒基本在紫外劑量較小時(shí)，就已被完全滅活。了解微生物滅活的紫外劑量，有利于紫外消毒設(shè)備實(shí)現(xiàn)更大的滅活率，為進(jìn)一步研發(fā)創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)。

但在文獻(xiàn)調(diào)研的過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題。不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，使用不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)方法，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往存在較大的差異，無(wú)法提供一個(gè)可靠和穩(wěn)定的參考值。另外，現(xiàn)在已有的研究大部分都是紫外在表面和水消毒領(lǐng)域的應(yīng)用，而空氣和食物等方面相關(guān)研究還很少，這應(yīng)該可以成為未來(lái)的研究方向。