閆孟琳，叢龍飛，張子玥，姜 民，聶 磊，白 鋼*

(1.南開大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室，天津 300353；2.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250100)

中藥材的質(zhì)量控制研究一直是行業(yè)關(guān)注的焦點問題之一?，F(xiàn)有質(zhì)量控制方法的樣品前處理繁瑣復(fù)雜，僅適用于實驗室研究[1]。如何建立簡便快捷的質(zhì)量評價方法，為中藥品質(zhì)提供有力保障是目前中藥質(zhì)量控制亟需解決的問題。近紅外光譜技術(shù)(NIRS)是一種整合分析技術(shù)，具有簡便快捷、低成本、綠色環(huán)保、不損壞樣品且可實現(xiàn)全程自動化檢測等特點。近年來，NIRS技術(shù)不斷發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于制藥、農(nóng)業(yè)、食品以及醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域[2-5]，為中藥質(zhì)量的快速評價提供了新的分析手段。

當(dāng)歸(AS)為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功效[6]。目前當(dāng)歸以甘肅岷縣的質(zhì)量最好，稱為“道地藥材”[7]。市場上流通的當(dāng)歸均為栽培品種，主產(chǎn)自甘肅、云南、湖北、四川等地[8]。由于受品種、栽培種植方法、產(chǎn)地氣候、采收加工方法、運輸貯藏條件等因素的影響，當(dāng)歸質(zhì)量存在著較大差異。目前《中國藥典》(2020年版)雖然對當(dāng)歸的水分、灰分、浸出物、揮發(fā)油、阿魏酸等的含量進行了限定，但這些指標(biāo)缺乏與當(dāng)歸功效的直接關(guān)聯(lián)，不能充分反映當(dāng)歸藥材的質(zhì)量屬性。質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)概念的提出為當(dāng)歸藥材的質(zhì)量控制提供了新的思路，其特點是利用能夠體現(xiàn)中藥有效性及安全性并可以檢測的化學(xué)指標(biāo)，對與中藥質(zhì)量相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)進行評價[9]。因此建立以Q-marker為核心的簡便快捷的分析體系用于當(dāng)歸質(zhì)量的評價具有重要意義。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被認(rèn)為是炎癥過程的主要介質(zhì)，在人體大多數(shù)炎癥疾病中呈高度激活狀態(tài)[10-11]。而當(dāng)歸在臨床上可用于治療動脈粥樣硬化、肺纖維化等疾病，可能與其能夠影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄，進而抑制組織炎癥、纖維化等過程有關(guān)[12-13]。本研究擬通過NF-κB抑制活性對當(dāng)歸抗炎Q-marker進行篩選，運用近紅外光譜技術(shù)及化學(xué)計量學(xué)方法探討其含量與整體抗炎功效的關(guān)系，建立一種以中藥質(zhì)量標(biāo)志物為導(dǎo)向的當(dāng)歸品質(zhì)快速管理體系，為當(dāng)歸的品質(zhì)監(jiān)管提供新的研究思路和方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC/Q-TOF Premier液質(zhì)聯(lián)用儀、UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)(美國Waters公司)；高速臺式冷凍離心機(MIKRO 220R，德國Hettich公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(FORMA311，美國Thermo公司)；熒光檢測儀(Modulus，美國Turner Designs公司)；布魯克傅里葉變換近紅外光譜儀(Tensor37，德國Brucker公司)；OPUS 7.0軟件(德國Brucker公司)。

色譜純乙腈、甲醇、甲酸(美國Sigma公司)；細(xì)胞培養(yǎng)用試劑(美國Gibco公司)；雙熒光素酶報告基因試劑盒(美國Promega公司)；綠原酸(Chlorogenicacid,CA)、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A(Levistilide A,Lev A)(純度≥ 98%，上海源葉生物科技)；阿魏酸(Ferulicacid,FA)(純度≥ 99%，上海麥克林生化科技)；洋川芎內(nèi)酯I(Senkyunolide I,SK I)、Z-藁本內(nèi)酯(Z-Ligustilide,Z-Lig)(純度≥ 98%，上海麥克林生化科技)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 藥材與細(xì)胞

200批當(dāng)歸藥材購自甘肅隴西當(dāng)歸藥材市場，經(jīng)甘肅數(shù)字本草檢驗中心王浩亮工程師鑒定為傘形科藥材當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels。人胚腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞系(HEK 293T)購于北京博奧派克生物科技(批號:SL401)。

1.3 實驗方法

1.3.1 當(dāng)歸提取物的制備取當(dāng)歸藥材，粉碎，過100目篩得當(dāng)歸粉末。稱取0.5 g加入50 mL 70%(7∶3，體積比)甲醇水溶液，25 ℃超聲30 min，離心取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，收集續(xù)濾液，用于高效液相色譜(UPLC)分析。取500 μL剩余續(xù)濾液于96孔深孔板中，真空干燥后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 UPLC/Q-TOF測定參照文獻(xiàn)方法對當(dāng)歸提取物進行分析測定[14-15]。流出液經(jīng)10∶1分流，其中1/10部分直接進行質(zhì)譜檢測，另外9/10部分每間隔30 s收集至96孔深孔板中，真空干燥，得UPLC餾分。

1.3.3 基于雙熒光報告基因的NF-κB抑制活性檢測將HEK 293T細(xì)胞置于96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為70%時，分別加入NF-κB熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL 4.32(100 ng/孔)、內(nèi)參Renilla(9.6 ng/孔)和轉(zhuǎn)染試劑PEI(1 mg/mL)進行瞬時共轉(zhuǎn)染。20 h后細(xì)胞給藥，實驗分對照組(Con)、模型組(Mod，10 ng/mL TNF-α)、陽性藥組(Dex，10-5mol/L地塞米松)和當(dāng)歸提取物組(10-4、10-5、10-6g/mL)，以及不同濃度(10-4、10-5、10-6mol/L)抑制劑對照品組(綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、Z-藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A)、混合對照品組(Mixed standard,MS)(0.06 mg綠原酸+0.14 mg洋川芎內(nèi)酯I+1.21 mg Z-藁本內(nèi)酯溶于1 mL二甲基亞砜)、UPLC餾分組以及50批當(dāng)歸提取物組(10 mg/mL)。給藥6 h后，收集細(xì)胞，按照熒光素酶報告基因試劑盒的說明測定熒光強度值，并計算NF-κB相對抑制活性(熒光比率=NF-κB熒光值/Renilla熒光值)。

1.3.4 UPLC含量測定參照文獻(xiàn)液相條件進行UPLC定量分析[14]。以綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、Z-藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對照品為對照，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算相應(yīng)含量。

1.3.5 近紅外光譜法檢測采用布魯克傅里葉變換近紅外光譜儀，參照文獻(xiàn)方法[14]對當(dāng)歸樣品進行紅外光譜掃描。選擇其中50批活性成分差異較大的樣品光譜以及對應(yīng)Q-marker的UPLC含量測定結(jié)果，運用OPUS 7.0軟件進行定量建模，分別建立近紅外光譜快速檢測方法。

1.3.6 藥效成分含量與NF-κB抑制活性的擬合與應(yīng)用為了建立Q-marker含量、綠原酸(X1)、阿魏酸(X2)、洋川芎內(nèi)酯I(X3)、Z-藁本內(nèi)酯(X4)、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A(X5)與當(dāng)歸NF-κB抑制活性(Y)之間的函數(shù)關(guān)系，依據(jù)樣本數(shù)是變量數(shù)5倍的原則[16]，選取25批當(dāng)歸樣品，采用SIMCA(12.0)軟件進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)建模，獲得“量-效”關(guān)聯(lián)擬合函數(shù)。同時，另選取9批當(dāng)歸樣品對所建模型進行驗證，建立擬合函數(shù)方程。利用所建立的擬合函數(shù)，將近紅外光譜法所測藥材中Q-marker的含量導(dǎo)入擬合函數(shù)中計算Y值，通過Y值來綜合預(yù)測藥材的抗炎活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 當(dāng)歸中NF-κB抑制成分的譜效篩選

采用UPLC/Q-TOF譜效篩選方法對當(dāng)歸提取物中的NF-κB抑制成分進行篩選與鑒定。結(jié)果如圖1A～C所示，當(dāng)歸提取物中的各成分在UPLC的UV檢測及質(zhì)譜檢測(BPI)中得到較好分離。收集各時間段餾分進行抑制活性檢測，發(fā)現(xiàn)2.5、3.5、5、9、12 min餾分處顯示了明顯的NF-κB抑制效果(圖1D)，經(jīng)質(zhì)譜解析及對照品指認(rèn)(圖1E)，確認(rèn)其分別為綠原酸(m/z353.087 3[M-H]-)、阿魏酸(m/z193.053 3[M-H]-)、洋川芎內(nèi)酯I(m/z207.102 1[M+H-H2O]+)、Z-藁本內(nèi)酯(m/z191.107 5[M+H]+)和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A(m/z381.207 9[M+H]+)，初步確認(rèn)了潛在的Q-marker。

圖1 當(dāng)歸藥材中NF-κB抑制活性成分的UPLC/Q-TOF譜效篩選Fig.1 UPLC/Q-TOF combined with NF-κB inhibitory activity screening for ASA.UPLC chromatogram of AS extractive;B.BPI in positive mode;C.BPI in negative model;D.UPLC combine with NF-κB inhibitory activity screening;E.UPLC for mixed reference substances；1.CA,2.FA,3.SK I,4.Z-Lig,5.Lev A；compare with Mod group,*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;compare with Con group,###p<0.001;(x± s,n = 4)

2.2 NF-κB抑制成分的驗證及含量測定

分別取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、Z-藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A的對照品，依據(jù)上述NF-κB抑制活性檢測方法對其活性進行驗證。結(jié)果如圖2所示，所篩選出的5種成分均能劑量依賴地抑制由TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)(圖2)，驗證了該5種成分均具有NF-κB抑制活性。同時，選取50批當(dāng)歸樣品，以UPLC檢測上述各活性成分的含量。其中，綠原酸的含量范圍為0.106 1～1.054 mg/g，均值為0.251 6 mg/g；阿魏酸的含量范圍為0.193 4～0.744 2 mg/g，均值為0.526 9 mg/g；洋川芎內(nèi)酯I的含量范圍為0.080 8～1.911 mg/g，均值為0.841 3 mg/g；Z-藁本內(nèi)酯的含量范圍為2.248～12.30 mg/g，均值為5.853 mg/g；歐當(dāng)歸內(nèi)酯A的含量范圍為0.110 5～0.760 7 mg/g，均值為0.301 5 mg/g。

圖2 當(dāng)歸藥材中5種NF-κB抑制活性成分的評價Fig.2 Evaluation of 5 NF-κB inhibitory activity of AS compare with Mod group,*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;compare with Con group,###p<0.001;(x±s,n=5)

2.3 當(dāng)歸NF-κB抑制活性與含量的關(guān)系擬合

2.4 當(dāng)歸抗炎Q-marker的近紅外光譜擬合

采用交叉驗證的方法，分別對光譜預(yù)處理方法、光譜區(qū)段的選擇進行優(yōu)化。以相關(guān)系數(shù)(R2)、交叉驗證均方差(RMSECV)以及相對分析誤差(RPD)為評價指標(biāo)，對模型預(yù)測性能進行評判。其中RMSECV越小，R2越接近1，模型的準(zhǔn)確度及預(yù)測效果越好；RPD>3.0，則認(rèn)為所建模型具有較高可靠性，可用于后續(xù)分析[17-18]。

2.4.1 光譜預(yù)處理方法的選擇采用合適的光譜預(yù)處理方法對原始光譜進行處理，可減小光譜基線漂移，增強光譜的差異性，有利于特征信息的提取。本研究分別采用一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、消除常數(shù)偏移量(ECO)、多元散射校正(MSC)、正態(tài)變量校正(SNV)等方法對50批當(dāng)歸樣品的原始光譜(圖4A)進行預(yù)處理。結(jié)果如圖4B～D所示，優(yōu)選后的預(yù)處理方法分別為：綠原酸采用一階導(dǎo)數(shù)+SNV，洋川芎內(nèi)酯I采用ECO，Z-藁本內(nèi)酯采用MSC。

圖3 當(dāng)歸NF-κB抑制活性與Q-marker含量的關(guān)系擬合Fig.3 The fitting relationship between NF-κB inhibitory activity and Q-marker content of AS A.VIP plot;B.S-plot;C.NF-κB inhibitory activity for 25 batches of AS;D.regression trend of true value and predicted value;E.equivalence verification(x±s,n=3,ns:not significant)

2.4.2 光譜區(qū)間以及主因子數(shù)的確定為了提高近紅外光譜擬合的準(zhǔn)確性，進一步對上述3種Q-marker的最佳波數(shù)區(qū)間進行篩選和優(yōu)化，并確定其最佳建模區(qū)間：綠原酸為7 502.8～6 098.7 cm-1及5 450.6～4 598.1 cm-1區(qū)段，洋川芎內(nèi)酯為9 400.7～7 498.9 cm-1及6 102.5～5 774.6 cm-1區(qū)段，Z-藁本內(nèi)酯為7 502.8～5 446.8 cm-1及4 602～4 247.1 cm-1區(qū)段。所選最佳波段區(qū)間有效提取了光譜差異信息，較好地屏蔽了噪音等不良信號的干擾。同時，為了確保模型預(yù)測的穩(wěn)健性，對建模的最佳主因子數(shù)進行了考察。綜合模型R2、RMSECV和RPD的檢測結(jié)果，最終確定建模的主因子數(shù)，綠原酸為13，洋川芎內(nèi)酯I為7，Z-藁本內(nèi)酯為12。綠原酸、Z-藁本內(nèi)酯的主因子數(shù)相對洋川芎內(nèi)酯I偏大說明其近紅外預(yù)測更為復(fù)雜。本研究基于建模效果，選擇較少的主因子數(shù)，在保障模型預(yù)測能力的同時兼顧了分析效率。

2.4.3 定量模型的建立以“2.3”部分的50批當(dāng)歸樣品作為樣本集，根據(jù)上述UPLC的含量測定結(jié)果，采用交叉檢驗?zāi)Ｊ?，選用最佳光譜預(yù)處理方法、波數(shù)區(qū)間以及主因子數(shù)，通過偏最小二乘法進行建模，得到3種Q-marker的定量模型。結(jié)果如圖4E～G所示，NIRS模型預(yù)測值與UPLC測定值表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，模型擬合能力良好，R2、RMSECV及RPD均可以滿足預(yù)測要求。

2.5 當(dāng)歸藥材抗炎活性的快速評價

本文嘗試基于Q-marker的含量搭建近紅外光譜技術(shù)與抗炎活性之間的關(guān)系。首先，依據(jù)上述所建立的近紅外定量模型，分別對另外的150批當(dāng)歸藥材中的3種Q-marker含量進行測定。得到綠原酸的含量范圍為0.111 4～1.032 mg/g，均值為0.524 1 mg/g(圖5A)；洋川芎內(nèi)酯I的含量范圍為0.096 8～1.341 mg/g，均值為0.624 5 mg/g(圖5B)；Z-藁本內(nèi)酯的含量范圍為2.300～12.23 mg/g，均值為4.850 mg/g(圖5C)。將獲得的含量測定結(jié)果分別導(dǎo)入上述NF-κB抑制活性預(yù)測的擬合方程，獲得相應(yīng)抗炎活性的預(yù)測Y值，最終通過近紅外光譜整合“量-效”關(guān)聯(lián)擬合分析，實現(xiàn)了對當(dāng)歸藥材抗炎功效的快速、精準(zhǔn)評價(圖5D)。

圖4 當(dāng)歸藥材中3種Q-marker的近紅外光譜分析Fig.4 NIR spectroscopy analysis for three Q-markers of ASA.original spectra;B,C and D.pre-processed spectra for CA,SK I and Z-Lig,respectively;E,F and G .quantitative model of CA,SK I and Z-Lig,respectively

3 結(jié) 論

本研究采用UPLC/Q-TOF技術(shù)結(jié)合NF-κB雙熒光素酶報告基因譜效篩選方法，對當(dāng)歸藥材中具有NF-κB抑制作用的Q-marker成分進行了篩選、鑒定與評價，確認(rèn)綠原酸、洋川芎內(nèi)酯I、Z-藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵Q-marker。并通過近紅外光譜技術(shù)建立了上述Q-marker成分的快速檢測方法。此外還運用化學(xué)計量學(xué)手段，建立了Q-marker成分含量與整體抗炎功效的擬合關(guān)系函數(shù)，最終實現(xiàn)了以Q-marker為核心，通過近紅外光譜掃描對當(dāng)歸抗炎功效的快速評價，為當(dāng)歸藥材品質(zhì)的快速評價與監(jiān)管提供了創(chuàng)新方法。