陳 希，劉良玉，張 靜，劉緒平，羅躍華，張文婷

（1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌330029；2.江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，江西 南昌330029）

鮮竹瀝收錄在《本草經(jīng)集注》中，為禾本科植物粉綠竹及同屬植物的鮮桿經(jīng)加熱后獲得的液體，主產(chǎn)于浙江、江西、福建等地，現(xiàn)收錄在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥材第一冊(cè)中，具有清熱化痰之功效，主要用于治療肺熱咳嗽、多痰、小兒痰熱驚風(fēng)等癥狀[1-3]。中藥水溶性液體制劑含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，容易滋生和繁殖微生物，一般需添加抑菌劑（也稱防腐劑）以防范藥品在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和使用中由微生物污染導(dǎo)致的藥品變質(zhì)[4,5]。但加入過(guò)量的抑菌劑，又會(huì)增加副作用，長(zhǎng)期飲用會(huì)引起人慢性苯中毒，主要表現(xiàn)為神經(jīng)衰弱，如頭痛、頭暈等[6]。鮮竹瀝一般以苯甲酸鈉作為抑菌劑，其抑菌效果主要取決于其未解離的酸分子，所以一般調(diào)節(jié)藥液pH 值為弱酸性[7]。苯甲酸鈉作為鮮竹瀝處方中重要組成部分，是否正確使用直接關(guān)系到鮮竹瀝的質(zhì)量，《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥材第一冊(cè)鮮竹瀝標(biāo)準(zhǔn)缺少苯甲酸的測(cè)定。

目前，對(duì)苯甲酸的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜（HPLC）法、氣相色譜法等[8-10]。由于中藥制劑中物質(zhì)復(fù)雜，本研究選用前處理簡(jiǎn)便又能消除干擾的HPLC 法測(cè)定鮮竹瀝中苯甲酸的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

島津LC-6AD 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）；梅特勒-托利多MS205DU 電子天平；梅特勒-托利多FE20K pH 計(jì)。

鮮竹瀝（市售）；陰性樣品（未加苯甲酸鈉的鮮竹瀝，按鮮竹瀝制法自制）；苯甲酸鈉對(duì)照品（來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100433-201702，苯甲酸鈉含量：99.7%）；KH2PO4、H3PO4：分析純；甲醇（色譜純）。實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Xpeonyx C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1mol·L-1KH2PO4緩沖液（用H3PO4調(diào)pH值至4.0）-甲醇（65∶35），流量為1.0mL·min-1；柱溫：40℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：227nm；樣品進(jìn)樣體積：10μL。

1.3 溶液配制

對(duì)照品溶液 精密稱取苯甲酸鈉對(duì)照品25.19mg，置于25mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，精密量取上述溶液5mL，置于50mL 量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，搖勻。

供試品溶液 精密量取鮮竹瀝樣液5mL，置100mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

陰性樣品溶液 取陰性樣品按供試品溶液制備方法制備。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相的選擇

掃描苯甲酸鈉光譜圖，發(fā)現(xiàn)其在227nm 波長(zhǎng)處有最大吸收。以0.01mol·L-1KH2PO4緩沖液作為鹽相進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該濃度苯甲酸峰前延且理論板數(shù)較差（拖尾因子0.653、理論塔板數(shù)9376），另采用0.1mol·L-1KH2PO4緩沖液時(shí)苯甲酸峰型更好（拖尾因子0.875、論塔板數(shù)17566）。還試驗(yàn)了以NH4Ac 緩沖液作為鹽相的情況，由于NH4Ac 在碳氧鍵在227nm 波長(zhǎng)下有吸收且NH4Ac 濃度較高，導(dǎo)致基線噪音很大。綜合考慮選擇0.1mol·L-1KH2PO4緩沖液作為鹽相，并以227nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，以降低基線噪音和檢出限。

2.2 流動(dòng)相pH 值的選擇

調(diào)節(jié)0.1mol·L-1KH2PO4緩沖液pH 值至5.5，甲醇比例5 %時(shí)苯甲酸出峰時(shí)間約為13min，且12min后還有較多鮮竹瀝的雜質(zhì)峰，需要較長(zhǎng)分析時(shí)間或采用梯度分析才能將雜質(zhì)峰洗脫出來(lái)。利用苯甲酸為酸性物質(zhì)，在酸性條件下保留時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)的特性，調(diào)節(jié)鹽相pH 值至4.0，甲醇比例調(diào)整為35%，苯甲酸出峰時(shí)間仍約為12min，但鮮竹瀝峰已洗脫完畢，消除了雜質(zhì)對(duì)苯甲酸測(cè)定的干擾，節(jié)約了樣品分析測(cè)定時(shí)間，提高了工作效率。故鹽相pH 值選擇調(diào)節(jié)到4.0。

2.3 專屬性考察

供試品、對(duì)照品和陰性溶液按上述色譜條件實(shí)驗(yàn)，分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10μL，注入色譜儀，色譜圖見圖1。

由圖1 可知，供試品溶液主峰保留時(shí)間與苯甲酸鈉對(duì)照品溶液主峰一致，陰性樣品溶液12min 后已無(wú)峰出現(xiàn)，鮮竹瀝峰已全部洗脫完畢，說(shuō)明本方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系

按1.2 色譜條件，取對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣1、2、5、10、20、30、40μL 并記錄色譜圖。以苯甲酸鈉的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以苯甲酸鈉的質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性回歸方程為y=4.0450×106x-1.0762×104，線性相關(guān)系數(shù)r2=1.0000。結(jié)果表明苯甲酸鈉質(zhì)量在0.1～4.0μg 之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度和重復(fù)性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按“1.2”的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，苯甲酸鈉峰面積（4067830、4074126、4073005、4073064、4071120、4073588）的RSD 為0.1%，說(shuō)明方法精密度良好。取鮮竹瀝樣液（A 企業(yè)，批號(hào)：20190503）按“1.3”方法制備供試品6 份并按“1.2”的色譜條件分析，6 份樣品中苯甲酸鈉峰面積（4947406、4939417、4937455、4945242、4939141、4934722）的RSD 為0.1%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.6 定量限和檢出限

取對(duì)照品溶液倍比稀釋，按“1.2”的色譜條件分析，以信噪比滿足3∶1 和10∶1 計(jì)算檢出限和定量限。計(jì)算得本方法苯甲酸鈉的檢出限和定量限分別為0.3ng 和1ng。

2.7 回收試驗(yàn)

精密稱取苯甲酸鈉對(duì)照品58.59mg 置25mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取鮮竹瀝樣液（E 企業(yè)，批號(hào)：190703）2.5mL，置100mL 量瓶中，分別按低中高3 個(gè)濃度分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.5 和4.0mL，再加水稀釋至刻度，搖勻，每個(gè)濃度水平平行制備3 份。按“1.2”中色譜條件分析，記錄色譜圖并計(jì)算回收率。回收率為100.67%～102.38%，回收率RSD 為0.7%，平均回收率為101.6%。說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度良好，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

2.8 樣品測(cè)定

供試品溶液按“1.2”中色譜條件分析，記錄色譜圖并計(jì)算鮮竹瀝中苯甲酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of samples

3 結(jié)語(yǔ)

HPLC 法是應(yīng)用較廣泛的一種測(cè)定苯甲酸的方法，但鮮竹瀝中基質(zhì)復(fù)雜、干擾峰較多，本研究通過(guò)對(duì)鹽相組成、流動(dòng)相pH 值和有機(jī)相比例的優(yōu)化，消除了基質(zhì)干擾、降低了檢出限、節(jié)省了分析時(shí)間，該方法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、專屬性好，適用于鮮竹瀝中苯甲酸的測(cè)定。