徐小紅，余正和，李 靜，李 軼，王姝琪，閆 盼，宋明芬，王晟東

杭州市第七人民醫(yī)院 1精神科 2心身科 3分子生物學(xué)實驗室 4影像科，杭州 310013

重度抑郁癥(major depressive disorder，MDD)是一個重要的社會公共衛(wèi)生問題，影響著全世界的患者。MDD可能導(dǎo)致患者社會心理障礙、生活質(zhì)量下降，發(fā)病率高，并伴隨著高致殘率和高死亡率[1]。盡管使用各種抗抑郁藥物治療抑郁癥，但至少50%的患者表現(xiàn)出較差的反應(yīng)[2]。抗抑郁藥對單胺能系統(tǒng)的快速作用已得到廣泛認可，但對于長期治療的作用機制，目前尚無共識。考慮到MDD的嚴(yán)重程度，了解其病因病理機制以及抗抑郁藥物的確切作用機制至關(guān)重要。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNAs已經(jīng)成為一系列發(fā)育、生理和認知過程的重要效應(yīng)物[3-4]。其中，miRNA132被認為在神經(jīng)精神疾病過程中，特別是抑郁癥的發(fā)病機制和神經(jīng)機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5- 8]。此外，幾個與抑郁癥相關(guān)基因如MECP2、CREB和period基因被驗證為miRNA132的靶點[9- 11]。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)能夠下調(diào)腦源性生神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，在抑郁癥的病理過程中起著至關(guān)重要的作用。miRNA132已經(jīng)被證明可通過BDNF，在腦神經(jīng)元可塑性和應(yīng)激反應(yīng)的基本機制中及在一些神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。因此，推測miRNA132也可能在抑郁癥癥狀的發(fā)病機制和神經(jīng)機制中發(fā)揮重要作用。本研究觀察了抑郁癥患者外周血白細胞及抑郁癥模型大鼠血液和前額葉皮層中miRNA132的表達情況。

材料和方法

臨床樣本采集2017年3月至2018年5月在杭州市第七人民醫(yī)院精神科門診治療的首發(fā)抑郁癥患者(抑郁組)41例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第5版抑郁的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)漢密爾頓抑郁量表(Hamilton depression scale，HAMD)評分≥17分；(3)漢族；(4)年齡18～45歲；(5)本人知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他精神疾?。?2)合并心腦血管及其他軀體疾??；(3)孕婦和哺乳期婦女；(4)酗酒、吸煙史≥1年、服用過精神活性物質(zhì)或鎮(zhèn)靜藥物。同期招募的健康志愿者(對照組)31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～45歲的中國漢族；(2)HAMD評分≤7分；(3)體檢各項指標(biāo)合格；(4)本人知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心腦血管疾病及其他軀體疾??；(2)有精神障礙史；(3)孕婦及哺乳期婦女；(4)酗酒、吸煙量大、喝濃茶或咖啡依賴者、服用過精神活性物質(zhì)或鎮(zhèn)靜藥物。本研究經(jīng)杭州市第七人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或近親屬知情并簽署同意書。

HAMD量表評估：HAMD量表評估由兩位副主任醫(yī)師完成。

血液樣本采集及處理：受試者入組后取靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，工作人員必須在2 h內(nèi)處理血液樣本，期間必須保存于低溫(4℃)。血液處理：加入3倍體積的紅細胞裂解液(天根生化科技)，混勻后室溫靜置5 min，10 000 r/min(r=5 cm)離心5 min，去上清取沉淀(白細胞)，加入Trizol(TaKaRa)試劑1 ml，混勻后于-80℃冰箱內(nèi)保存，待后續(xù)一起提取總RNA。

動物實驗雄性SD大鼠24只，7周齡，體質(zhì)量200～250 g，購于浙江斯萊克實驗動物中心。用白色塑料籠飼養(yǎng)，室溫控制在(22±2)℃，濕度為(50±10)%，保持12 h(6∶00～18∶00)循環(huán)照明，大鼠自由攝取食物與水。SD大鼠進入實驗區(qū)后先飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，然后再開始后續(xù)實驗。所有動物實驗經(jīng)杭州市第七人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程盡量減少動物痛苦。

采用配對比較法將SD大鼠隨機分為對照組和CUMS組，每組12只。對照組大鼠每籠3只(糖水偏好實驗時每籠1只)，CUMS組大鼠孤養(yǎng)。對照組大鼠正常喂食飼養(yǎng)，CUMS組大鼠在4周內(nèi)接受各種應(yīng)激，且對照組與其CUMS組大鼠分開不同房間飼養(yǎng)。CUMS的應(yīng)激方法參照以往文獻中的方法[12]，并做了部分調(diào)整，應(yīng)激方法包括以下幾種：(1)禁食24 h；(2)禁水24 h；(3)夜間傾斜籠子(45°)；(4)24 h晝夜顛倒；(5)冰水浴5 min；(6)潮濕墊料(100 g鋸末墊中溢出300 ml水)24 h；(7)1 min尾部擠壓(燕尾夾夾尾巴近體端1/3處)；(8)45℃熱水浴5 min；(9)水平振動(搖床，每秒1次)15 min。每天隨機選擇其中1或2種應(yīng)激，2 d內(nèi)不連續(xù)施加相同的應(yīng)激，應(yīng)激持續(xù)進行4周。

在最后一次行為學(xué)檢測后，用戊巴比妥鈉(1%溶液，0.6 ml/100 g，腹腔注射)深度麻醉、犧牲大鼠。將軀干血收集到含有EDTA的冰預(yù)冷管中，部分以3000 r/min(r=5 cm)離心20 min，然后分離血漿分裝后于-80℃保存，用于后續(xù)皮質(zhì)酮水平測量；部分用紅細胞裂解液處理，分離出白細胞，用于提取RNA。同時，將大鼠的大腦迅速從顱骨中取出，在冰預(yù)冷的PBS緩沖液中清洗，置于預(yù)冷的金屬板上快速解剖大腦，分離前額葉皮層。將前額葉皮層在液氮中速凍后，于-80℃下保存，用于后續(xù)實驗。

糖水偏好實驗：同時給所有大鼠(每籠1只)2%蔗糖溶液和普通飲用水，大鼠可以在2%蔗糖溶液和飲用水中自由選擇，通過稱重計算出大鼠在2 h內(nèi)攝取蔗糖水和飲用水的量，并采用以下公式計算糖水偏好：糖水偏好=蔗糖溶液攝入量/(蔗糖溶液攝入量+飲用水?dāng)z入量)×100%。糖水偏好<65%的大鼠認為快感缺失[13]。

強迫游泳實驗：強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST)主要參考Ji等[14]所描述的方法，并進行了一定的修改，具體為：在高為50 cm、直徑為30 cm的透明圓柱形塑料容器中加入約30 cm深的水，水溫保持在(22±2)℃(同室溫)。將大鼠放入容器中后，用EthoVision XT軟件記錄視頻，并分析大鼠7 min內(nèi)的不動時間(s)。

相關(guān)分子檢測

大鼠血漿皮質(zhì)酮水平檢測：大鼠血漿皮質(zhì)酮水平用皮質(zhì)酮(可的松酮)酶聯(lián)免疫試劑盒(德國IBL公司)測定，檢測方法參照試劑盒說明書，檢測不同樣本中所含皮質(zhì)酮水平(nmol/L)。

miRNA132表達水平測定：采用Trizol試劑進行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)進行逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)進行定量檢測，儀器為ABI公司的StepOne Plus實時熒光定量PCR儀。miRNA132人源引物和大鼠引物均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。比較各組間miRNA132相對表達量。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

抑郁癥患者外周血白細胞miRNA132表達高于對照組抑郁癥患者外周血白細胞miRNA132水平為2.37±0.36，明顯高于對照組的1.34±0.16(t=2.355，P=0.0213)(圖1)。抑郁癥組患者外周血白細胞miRNA132表達水平與HAMD17得分呈顯著正相關(guān)(P=0.0004，rs=0.5303，n=41)(圖2)。

CUMS建模情況建模4周后，F(xiàn)ST顯示CUMS組大鼠不動時間為(72.67±2.95)s，明顯多于對照組的(40.00±5.49)s(t= 2.366，P=0.0395)；糖水偏好實驗結(jié)果顯示，CUMS組大鼠蔗糖消耗為(55.67±6.42)%，明顯低于對照組的(98.21±1.28)%(t=6.502，P<0.0001)；大鼠血漿皮質(zhì)酮水平檢測結(jié)果顯示，CUMS組大鼠血漿皮質(zhì)酮水平為(1396.0±254.9)nmol/L，明顯高于對照組的(557.3±158.4)nmol/L(t=2.795，P=0.0190)。

大鼠miRNA132的表達情況CUMS組大鼠血液中白細胞和前額葉皮層中的miRNA132表達水平分別為2.32±0.88和2.80±0.76，明顯高于對照組的1.18±0.36(t=2.273，P=0.0463)和0.99±0.23(t=2.553，P=0.0287)。

MDD：重度抑郁癥

HAMD：漢密爾頓抑郁量表

討 論

研究表明，miRNA132表達具有組織特異性，在神經(jīng)組織中高度表達，參與軸突生長、突觸增殖分化和神經(jīng)腫瘤形成過程[15]。神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中miRNA132的表達介導(dǎo)了BDNF的作用，而BDNF低水平與抑郁癥有關(guān)[16- 17]。本結(jié)果表明，MDD患者外周血樣本中miRNA132表達升高，與以往研究結(jié)果一致[2，11，18- 19]；相關(guān)性分析結(jié)果也提示抑郁癥患者的HAMD17評分與miRNA132水平呈正相關(guān)，且CUMS模型大鼠血液和前額葉皮層miRNA132表達升高，提示miRNA132可能是控制抑郁癥應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)元存活的關(guān)鍵因素。

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs對抑郁、焦慮和抗抑郁藥物的作用有重要作用。在一定的病理生理條件下，miRNAs被釋放到細胞外，可能通過出芽和微囊脫落等途徑進入血液循環(huán)[20]。miRNA132參與軸突生長、增殖和突觸分化[15]。miRNA132在免疫系統(tǒng)中也有潛在的作用[21]。利用動物模型的行為學(xué)研究也表明miRNA132的重要作用：Hansen等[22]在小鼠前腦中過表達miRNA132，導(dǎo)致小鼠的識別記憶受損；Scott等[23]發(fā)現(xiàn)，miRNA132在大鼠嗅周皮層選擇性特異過表達與短期識別記憶損傷相關(guān)。而miRNA132與抑郁癥之間的因果關(guān)系還有待進一步驗證。本研究結(jié)果表明，臨床抑郁癥患者外周血miRNA132表達趨勢與抑郁模型大鼠的miRNA132表達趨勢一致；此外在抑郁模型大鼠中，血液中miRNA132表達與前額葉皮層中的表達也是一致的，血液中miRNA132表達可以在一定程度上反映前額葉皮層的miRNA132表達變化趨勢。

本研究存在以下局限性：(1)人群樣本量相對較小；(2)本組MDD患者沒有隨時間隨訪，因此很難確定miRNA132表達在抑郁癥狀改善中的變化。本研究結(jié)果僅僅觀察到抑郁癥患者及抑郁模型大鼠miRNA132表達變化情況，然而要進一步證實這些現(xiàn)象并闡明其具體機制還需要進一步的研究來證實：如通過尸檢抑郁癥患者相應(yīng)腦區(qū)相關(guān)分子的表達水平，從而更準(zhǔn)確地觀察其變化情況；通過體外細胞實驗以及在體動物實驗進行相關(guān)的分子機制研究等。