董小歡 吳建新

隨著國內(nèi)人民生活水平的提高以及二胎政策的放開，補充葉酸等優(yōu)生優(yōu)育措施被越來越多的民眾所重視。葉酸是水溶性維生素B9，作為一碳單位的載體，主要參與DNA 合成和DNA甲基化這兩個重要的生物化學(xué)過程[1]。葉酸缺乏在發(fā)育異常、衰老、腫瘤等各種疾病中發(fā)揮著重要作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[2]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)發(fā)生凋亡[3]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞死亡的一種類型，但是葉酸缺乏和自噬關(guān)系尚未明確。因此，本研究選取mESCs為研究模型，探索葉酸缺乏是否可能誘發(fā)自噬。

資料與方法

1.材料：小鼠胚胎干細(xì)胞由本實驗室凍存；葉酸粉末購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(含葉酸)、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、DPBS(無鈣鎂)、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、2-巰基乙醇、胰酶替代品均購自GIBCO公司；重組小鼠白血病抑制因子購自Millipore公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(不含葉酸)購自北京思賽因公司；明膠購自Amresco公司；哺乳動物蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；LC3和β-actin抗體均購自Cell Signal Technology公司。

2.mESCs常規(guī)培養(yǎng)和分組：胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(正常對照組,Control)包括DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖含量4 500 mg/L、葉酸含量4 mg)、15%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素/鏈霉素100 U/L、2-巰基乙醇0.1 mmol/L、非必需氨基酸0.1 mmol/L、丙酮酸鈉1 mmol/L、重組小鼠白血病抑制因子1 000 U/L。葉酸缺乏組(FD)完全培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基(不含葉酸)中添加葉酸2 mg，其余成分同正常對照組，且細(xì)胞培養(yǎng)條件不變。在0.2%明膠包被培養(yǎng)板，將液氮中凍存的mESCs取出進行復(fù)蘇后，置于明膠上，加入正常對照組培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換正常對照組完全培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)至48 h進行傳代，收集細(xì)胞離心去上清后，往細(xì)胞沉淀中加入FD組的完全培養(yǎng)基吹打混勻至單細(xì)胞狀態(tài)，將等量細(xì)胞分別加入Control組和FD組的完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換兩組細(xì)胞各自的完全培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h這4個時間點收集Control組和FD組的細(xì)胞，離心去上清后保留細(xì)胞沉淀用于后續(xù)實驗。

3.熒光實時定量PCR法檢測LC3B和Foxo3的表達：分別在4個時間點(12 h，24 h，36 h，48 h)下，收獲培養(yǎng)的兩組細(xì)胞(Control組和FD組)，根據(jù)試劑盒步驟分別提取兩組細(xì)胞的總RNA，Nanodro P1000分光光度計測總RNA濃度；Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，0～5 ℃ 5 min；然后根據(jù)Fast SYBR Mixture試劑盒步驟進行real time PCR反應(yīng)，體系為25 μl；LC3引物序列為F:5′-CCAGTGATTATAGAGCGATAC-3′,R:5′-AGGAAGAAGGCTTGGTTAG-3；Pik3r1引物序列為F:5′-CATTGACAGTAGGAGGAGGTTGGAA-3′，R:5′- TTTCTGCGTCAGCCACATCAAGTAT-3′；Pik3r3引物序列為F:5′- TCACAAATGGAATGAAGGACAG-3′，R:5′-AGGCATCACGAACTAAGAAGGT-3′；Akt1引物序列為F:5′-ACTCATTCCAGACCCACGACC-3′，R:5′-CAGACACAATCTCCGCACCAT-3′；內(nèi)參β-actin引物序列為F:5′-TTCCAGCCTTCCTTCTTG-3′，R:5′-GGAGCCAGAGCAGTAATC-3′；擴增條件為95℃ 20 s預(yù)變性，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，每份樣品做3個復(fù)孔；基因表達變化均采用2- △△ Ct相對定量分析法。以β-actin為內(nèi)參基因，熒光實時定量PCR法檢測兩組細(xì)胞中LC3B和Foxo3的表達，檢測三者在mRNA水平的表達量[4-5]。

4.免疫印記實驗檢測LC3B的表達：根據(jù)試劑盒步驟分別裂解兩組細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，40 g蛋白樣品以15%SDS-PAGE膠分離后每份樣品做3個復(fù)孔，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，分別加兔抗LC3單克隆抗體(1:1 000)、兔抗Actin單克隆抗體(1:1 000)過夜；TBST洗膜3次，10 分鐘/次，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 分鐘/次，增強型 ECL化學(xué)發(fā)光成像，X膠片曝光顯影，掃描為照片，最后利用Quantity One軟件對條帶行分析。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用Excel 2007統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P值<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.葉酸缺乏對自噬關(guān)鍵蛋白LC3B表達水平和mRNA水平的影響：mESCs分別在FD組和Control組中培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后，通過免疫印跡雜交法以β-actin作為內(nèi)參，檢測自噬關(guān)鍵蛋白LC3B的表達量。在LC3B的免疫印跡中(圖1)，LC3B通常出現(xiàn)兩條帶，即LC3B-I的表觀分子量為18 KDa，LC3B-II的表觀分子量為16 KDa，但是LC3B抗體與LC3B-II的親和力高于LC3B-I。圖1的結(jié)果進行灰度掃描后，將Control組的灰度值均設(shè)為1，觀察4個時間點下FD組的LC3B表達量變化(圖1)，僅12 h、36 h的變化具有統(tǒng)計學(xué)意義，而且36 h的LC3B表達量上調(diào)。該實驗提示當(dāng)葉酸缺乏條件培養(yǎng)mESCs 36 h，自噬活性可能增強。

通過相對定量PCR法，檢測自噬關(guān)鍵基因LC3B在mRNA水平的相對表達量。結(jié)果顯示(圖2)，與Control組相比，F(xiàn)D組在4個時間點中僅36 h的差異為1.63倍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且表達上調(diào)，提示葉酸缺乏條件下培養(yǎng)mESCs 36 h，自噬活性可能增強。

LC3B在mRNA和蛋白水平的趨勢，以36 h最為顯著，48 h出現(xiàn)下降，而12 h時FD組表達量反而低于Control組。

圖1 葉酸缺乏對自噬關(guān)鍵蛋白LC3B表達水平的影響

圖2 葉酸缺乏對自噬關(guān)鍵蛋白LC3B的mRNA水平影響

2.葉酸缺乏對自噬信號通路上相關(guān)基因的影響：FD組和Control組培養(yǎng)36 h的mESCs提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，采用SYB Green法實時相對定量PCR檢測葉酸缺乏條件下，PI3K/Akt信號通路上的4個關(guān)鍵分子Pi3r1、Pi3r3、Akt1和Foxo3相對正常對照組的表達量變化(圖3)。相對于Control組，F(xiàn)D組中這4個基因中僅Foxo3表達上調(diào)1.3倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而Pi3r1表達下調(diào)1.1倍，Pi3r3和Akt1的表達分別上調(diào)1.04和1.03倍均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義。說明Foxo3可能參與葉酸缺乏誘導(dǎo)自噬過程的主要途徑。

圖3 葉酸缺乏對自噬信號通路上相關(guān)基因的影響

討論

本實驗分別在葉酸缺乏(FD組)和正常葉酸(Control組)水平兩種條件下培養(yǎng)mESCs，然后在蛋白水平和mRNA水平均對兩組細(xì)胞進行自噬關(guān)鍵蛋白LC3B的檢測，結(jié)果提示細(xì)胞培養(yǎng)36 h，F(xiàn)D組的自噬關(guān)鍵蛋白LC3B的表達量出現(xiàn)上調(diào)且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，反映自噬活性可能增強，提示葉酸缺乏可能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。通常認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境的刺激或在內(nèi)部環(huán)境或條件發(fā)生變化時都可以發(fā)生自噬上調(diào)。其中常見的外部因素包括氨基酸或游離脂肪酸等在內(nèi)的營養(yǎng)缺乏，以及激素、缺血、缺氧是細(xì)胞自噬的重要誘導(dǎo)因素。另外雌激素、雄激素和纖維生長因子-2(FGF-2)等均可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。內(nèi)部因素包括細(xì)胞器損傷、異常成分積聚或必需成分存在和病原體存在[6]。本實驗證實以葉酸缺乏為例的營養(yǎng)缺乏同樣可能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

LC3B-II的含量或 LC3B-II/LC3B-I的比例與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)，在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性[4]。本研究FD組的自噬關(guān)鍵蛋白LC3B在mRNA水平和蛋白水平均顯著上調(diào)，提示葉酸缺乏誘導(dǎo)的自噬在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控LC3B的表達，有LC3B在mRNA和蛋白水平的趨勢是隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的推移，表達量逐漸上調(diào)，以36 h最為顯著，48 h出現(xiàn)下降，考慮可能與該時間點部分細(xì)胞活性降低有關(guān)。而12 h時FD組表達量反而低于Control組，分析可能與培養(yǎng)時間尚短，細(xì)胞尚未適應(yīng)該組的培養(yǎng)基條件，故影響細(xì)胞活性，從而影響了蛋白的表達。研究表明，在人和大鼠的自噬過程中，LC3B通常在翻譯后水平受到調(diào)控[7]。本研究與現(xiàn)有的研究結(jié)論不同的是調(diào)控階段的差異，這可能與物種、細(xì)胞系和誘導(dǎo)因素的不同有關(guān)。

選擇與自噬相關(guān)的PI3K/Akt信號通路上的4個關(guān)鍵分子Pi3r1、Pi3r3、Akt1和Foxo3，在mRNA水平檢測它們的表達情況[5,8]。本實驗經(jīng)熒光定量PCR驗證，Pik3r1、Pik3r3、和Akt1在mRNA水平并無明顯變化，但是Foxo3表達上調(diào)1.3倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Pik3r1、Pik3r3和Akt1沒有變化，后續(xù)應(yīng)通過蛋白水平的檢測如免疫印跡雜交證明PI3K/Akt通路是否參與葉酸缺乏誘導(dǎo)的自噬。Foxo3屬于轉(zhuǎn)錄因子，Mammucari等[9]研究發(fā)現(xiàn)肌肉生長中Akt激活了由mTOR介導(dǎo)的蛋白合成，而Foxo介導(dǎo)的蛋白降解則受到抑制。在許多生物體內(nèi)，F(xiàn)oxo反向調(diào)控mTOR信號通路。Foxo3在骨骼肌的自噬中發(fā)揮了必要的作用，饑餓狀態(tài)下可激活自噬相關(guān)蛋白LC3B和Bnip3的轉(zhuǎn)錄，這個過程正是受到Foxo3的調(diào)控。Foxo3作為轉(zhuǎn)錄因子參與對LC3B的誘導(dǎo)，它是饑餓誘導(dǎo)的自噬中所必需的；在肌肉萎縮中，同時調(diào)控著泛素蛋白酶體和自噬溶酶體。由此可以推斷，葉酸缺乏可能使PI3K/Akt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，對轉(zhuǎn)錄因子Foxo3的抑制作用減弱從而使促自噬因子Foxo3的表達增加，DNA轉(zhuǎn)錄水平提高，大量的自噬相關(guān)基因如LC3B和Beclin1的高表達最終誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。因此，葉酸缺乏誘導(dǎo)的自噬可能主要是通過PI3K/Akt通路參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究提出了葉酸缺乏可能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，探索了葉酸缺乏可能與自噬相關(guān)，為深入研究神經(jīng)管畸形的發(fā)病機制提供了新的思路[10-11]，為孕期補充葉酸的必要性提供了理論依據(jù)。