成 福，王萬能

（重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054）

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，我國每年產(chǎn)生的禽畜糞便多達30億t，養(yǎng)殖場所產(chǎn)生的畜禽糞便已成為環(huán)境污染的重要因素之一。由于廢棄物處理技術相對滯后，大量糞污的隨意排放，造成了空氣、水質(zhì)及土壤污染等多種問題[1]。禽畜糞便中纖維素含量高，是可再生資源的重要組成部分[2]。禽畜糞便的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法能耗高，化學法在濃酸濃堿處理后，容易造成第二次污染，而生物法的反應條件溫和高效，無化學污染，適合禽畜糞便的處理[3]。傳統(tǒng)的堆肥技術就是利用自然界中現(xiàn)存的微生物菌群實現(xiàn)對有機物的氧化分解從而形成穩(wěn)定腐殖質(zhì)的過程。李吉進等[4]采用靜態(tài)堆肥工藝，以新鮮雞糞、牛糞為原料，工農(nóng)業(yè)廢棄物為填充劑，通過翻堆的方式進行通風供氧，經(jīng)過30d 才達到基本腐熟狀態(tài)。自然堆肥熟化速度慢，發(fā)酵效率較低，并且不易起溫，達不到我國堆肥無害化處理標準，需要進行優(yōu)化改進[5]。周文[6]建立了一種新型的好氧快速發(fā)酵生產(chǎn)有機肥的技術，首先清除原料輔料中的金屬、磚石等雜物，然后將糞便進行固液分離，調(diào)節(jié)原料含水率，再進行加熱處理后破碎為有機肥料半成品，然后堆肥發(fā)酵熟化。該工藝過程復雜，設備要求高，成本投入大，難以實現(xiàn)連續(xù)、大規(guī)模的處理。

因此本研究針對現(xiàn)有技術不足開發(fā)了一種混合發(fā)酵菌劑和微生物連續(xù)流動發(fā)酵床降解微生物的工藝，在傳統(tǒng)堆肥方法上進行優(yōu)化。通過在待堆肥發(fā)酵禽畜糞便中混合發(fā)酵引物和發(fā)酵菌液，能有效縮短發(fā)酵菌劑適應堆肥環(huán)境的時間，快速發(fā)揮降解酶的作用。通過連續(xù)發(fā)酵工藝還能實現(xiàn)對多批次禽畜糞便快速連續(xù)發(fā)酵的目的，提高禽畜糞便的堆肥發(fā)酵效率。開發(fā)的連續(xù)發(fā)酵工藝可解決農(nóng)村環(huán)境污染并發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，還能極大地推動生物肥料產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，對人類社會具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖場禽畜糞便，測定其有機質(zhì)含量79%，碳氮比16，含水率68%，pH 值7.25，稻殼粉少量。

牛肉膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉：成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉：成都市科隆化學品有限公司；苯酚：成都市科隆化學品有限公司；亞硫酸鈉：成都市科隆化學品有限公司；重鉻酸鉀：成都市科隆化學品有限公司。

假單胞菌（Pseudomonadaceae）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 10441；枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subspecies）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 10832；嗜熱液化芽胞桿菌（Bacillus thermoliquefaciens）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 20647。

1.2 儀器與設備

生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ZHWY-2102c 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；FE20pH 計：梅特勒—托利多儀器有限公司；紫外分光光度計：上海儀電儀器分析有限公司；自動壓力蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000mL，pH 值自然；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15～25g、蒸餾水1000mL，pH 值7.4～7.6。

1.4 方法

1.4.1 復合菌劑及發(fā)酵引物的制備

復合菌劑菌種由最適低溫產(chǎn)酶菌、最適常溫產(chǎn)酶菌、最適高溫產(chǎn)酶菌組成。最適低溫產(chǎn)酶菌為假單孢菌，最適常溫產(chǎn)酶菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種，最適高溫產(chǎn)酶菌為嗜熱液化芽孢桿菌。將假單孢菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、嗜熱液化芽孢桿菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)至濃度均達到108cfu/mL，培養(yǎng)溫度為28℃。培養(yǎng)完成后，按體積比1.5∶1∶1取調(diào)節(jié)好假單孢菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、嗜熱液化芽孢桿菌的培養(yǎng)液，混合制備成30L 的復合菌劑，備用。取60kg 禽畜糞便，添加稻殼粉調(diào)節(jié)禽畜糞便的含水率至50%～55%，添加活化的復合菌劑培養(yǎng)液30L，堆肥發(fā)酵至熟化，制備為發(fā)酵引物。

1.4.2 連續(xù)發(fā)酵流動床堆肥

取300kg 禽畜糞便，在2m×1m×0.5m 的發(fā)酵箱體中進行堆肥發(fā)酵，然后加入60kg 的發(fā)酵引物，混合攪拌均勻，添加活化的復合菌劑培養(yǎng)液15L，覆蓋薄膜保溫，發(fā)酵熟化。熟化完畢的禽畜糞便可作為發(fā)酵引物，留取部分與后續(xù)批次的待發(fā)酵禽畜糞便進行混合，即可實現(xiàn)禽畜糞便的連續(xù)堆肥發(fā)酵。對照組則取禽畜糞便300kg，堆放至2m×1m×0.5m的發(fā)酵箱體中，添加活化的復合菌劑15L，覆蓋薄膜保溫，發(fā)酵熟化。堆肥過程中，溫度計測定堆肥溫度，記錄堆肥過程中的溫度變化。堆肥過程中，每天取樣檢測分析堆肥物質(zhì)變化情況，樣品為多點混合采樣。采用K2Cr2O7容量法測定各混合樣的有機質(zhì)含量[7]，采用國家農(nóng)業(yè)標準NY525－2011測定各混合樣中C/N[8]，采用平板菌落計數(shù)法測定各混合樣微生物數(shù)量[9]，采用3.5—二硝基水楊酸顯色法測定各混合樣中纖維素酶活性[10]。

2 結果分析

2.1 堆肥溫度變化

堆肥溫度是判定堆肥腐熟程度的重要指標，溫度會通過影響微生物活性和有機物降解速率控制發(fā)酵進程。取禽畜糞便調(diào)節(jié)水分含量后，添加復合菌劑處理，隨著堆肥時間的延長，實驗組在堆肥過程中堆肥逐漸發(fā)生顏色變化，顏色略微加深，并產(chǎn)生有腐熟的氣味，表明熟化的過程的順利進行。實驗發(fā)現(xiàn)在堆肥第14d 時，堆肥的質(zhì)地變得疏松，且堆肥由黑色變?yōu)楹诤稚藭r表明該堆肥熟化完成。相對于實驗組的變化，對照組堆肥發(fā)酵熟化速度明顯落后于實驗組，堆肥顏色變化較實驗組變化慢，且在第18d 堆肥質(zhì)地才變得疏松，此時堆肥的顏色才從黑色變?yōu)楹诤稚_到熟化標準。如圖1所示，整個堆肥過程中，實驗組和對照組的堆肥溫度變化趨勢大致相同，均呈先上升后下降的變化曲線，實驗組在4d 達到最高溫度62℃。對照組在7d 達到最高溫度55℃。實驗組與對照組相比，實驗組堆肥升溫早、升溫快，表明實驗組的復合菌劑在待發(fā)酵禽畜糞便中的延滯期短，堆肥降解速率加快，堆肥發(fā)酵時間縮短。

2.2 堆肥微生物數(shù)量變化

堆肥中微生物種群數(shù)量的變化對堆肥快速腐熟影響程度大，是一個極其重要的指標參數(shù)。如圖2所示，加入發(fā)酵引物和復合菌劑后實驗組從堆肥發(fā)酵開始至溫度升高達到最高溫度62℃，微生物種群數(shù)量增長迅速，最高達到3.48×105cfu/g，而且后續(xù)堆肥發(fā)酵過程中微生物種群數(shù)量一直維持在較高水平，表示在堆肥過程的微生物適應環(huán)境較快，活動旺盛。而對照組在整個堆肥過程中，微生物種群數(shù)量增長相對較慢，直到高溫階段結束，微生物種群數(shù)量最高達到2.31×105cfu/g。加入發(fā)酵引物和發(fā)酵菌劑之后微生物種群數(shù)量增加，產(chǎn)酶量大，酶活性提高，有機物降解速率加快，進而縮短禽畜糞便的發(fā)酵進程。實驗表明在堆肥發(fā)酵過程中復合菌劑能迅速適應環(huán)境，并在溫度不同的階段都能發(fā)揮積極的作用。加入發(fā)酵引物后，實驗組與對照組相比，實驗組堆肥復合微生物菌群數(shù)量上升快，強烈的微生物活動也促進了堆肥的反應進程。加入發(fā)酵引物后使得堆肥升溫過程升溫早、升溫快，也促進了堆肥中復合微生物菌群的擴增，形成良性循環(huán)，使實驗組堆肥纖維素降解效率提高，加快了堆肥發(fā)酵腐熟速度，縮短了堆肥發(fā)酵時間，腐熟效果更好。發(fā)酵引物具有適合發(fā)酵菌群快速、繁殖、產(chǎn)酶的生長微環(huán)境，能有效縮短發(fā)酵菌的延滯期，快速地發(fā)揮發(fā)酵菌、降解酶的發(fā)酵降解作用，提高禽畜糞便的堆肥發(fā)酵效率。

2.3 堆肥纖維素酶活性變化

禽畜糞便中纖維素含量較多，因此堆肥過程纖維素酶活性直接影響堆肥的腐熟進程和發(fā)酵的強度，畜禽糞便中含有大量難以降解的纖維素，通過對堆肥中纖維素酶活性的測定，可以了解堆肥中纖維素降解的情況。加入發(fā)酵菌劑處理之后，在堆肥發(fā)酵過程中，實驗組堆肥前4d，堆肥溫度持續(xù)升高至最高溫度62℃，堆肥中的纖維素酶活性隨之升高，至發(fā)酵結束，纖維素酶活性保持在較高水平，第8d 最高達1.58U/g，而且到達高溫峰值之后，堆肥中的纖維素酶活性下降幅度較小，直至熟化完成時纖維素酶活性仍保持在1.47U/g。而對照組堆肥中的纖維素酶活性升高速度較慢，在第11d 纖維素酶才達到最高水平1.2U/g，如圖3所示。因此，相較于對照組，實驗加入發(fā)酵引物之后，纖維素酶活性最大值提高了31.7%，禽畜糞便發(fā)酵堆體中纖維素酶活性峰值比對照處理方法提前3d，且纖維素酶活性一直維持在較高水平。采用禽畜糞便連續(xù)發(fā)酵堆肥的方法處理禽畜糞便，與傳統(tǒng)堆肥發(fā)酵方法相比，該連續(xù)發(fā)酵堆肥方法可以提前提高禽畜糞便發(fā)酵堆肥纖維素酶活性的水平及峰值，利于降解禽畜糞便中大量的纖維素，達到快速、連續(xù)、規(guī)?；幚砬菪蠹S便的目的，有助于實現(xiàn)禽畜糞便轉(zhuǎn)變成綠色有機肥，成為環(huán)境友好型生物肥料，對于環(huán)境的保護，土壤質(zhì)地的改善有重要意義。

2.4 堆肥有機質(zhì)含量及碳氮比（C/N）變化

加入發(fā)酵引物，進行堆肥發(fā)酵。隨機多點取樣測定堆肥在15d 有機質(zhì)含量，實驗組為383.6g/kg，堆肥熟化完畢后有機質(zhì)含量降至60.5%。對照組堆肥在15d 有機質(zhì)含量為434.3g/kg，堆肥熟化完畢后有機質(zhì)含量降至66.7%。由堆肥中有機質(zhì)的變化量可知，實驗組與對照組相比，實驗組對禽畜糞便中有機質(zhì)的降解效果更好，實驗組的有機質(zhì)含量下降幅度較對照組更大，表明本實驗組可有效促進禽畜糞便中有機質(zhì)的降解。氮素的含量是堆肥過程中的重要控制參數(shù)，C/N 比是衡量氮素平衡的一種有效方式[11]。實驗組堆肥C/N 值與有機質(zhì)變化都呈下降的趨勢，熟化完畢后實驗組C/N 為12.3，對照組堆肥C/N 值為14.2。表明加入發(fā)酵引物進行發(fā)酵，禽畜糞便熟化度得到提高。

3 結 語

研究開發(fā)的發(fā)酵菌劑由最適低溫菌、最適常溫菌、最適高溫菌組成，并采用連續(xù)發(fā)酵流動床堆肥的方法進行堆肥處理，有利于實現(xiàn)堆肥的連續(xù)處理。與傳統(tǒng)堆肥發(fā)酵處理禽畜糞便方法相比，連續(xù)發(fā)酵堆肥實現(xiàn)讓堆肥快速升溫熟化的目的，提前4d 達到熟化的標準，促進了微生物群的增長及代謝活動，提前提高了禽畜糞便發(fā)酵堆肥纖維素酶活性的水平及峰值，較傳統(tǒng)堆肥方法提前3d 出現(xiàn)。相較于對照組，實驗組最大纖維素酶活力提高了31.7%。該流動床微生物發(fā)酵工藝中發(fā)酵引物具有適合發(fā)酵菌快速、大量繁殖、產(chǎn)酶的生長微環(huán)境，能有效縮短添加的發(fā)酵菌的延滯期，使發(fā)酵菌盡快適應新的生存環(huán)境，能快速擴大種群數(shù)量，快速產(chǎn)生纖維素酶，高效、快速地發(fā)揮發(fā)酵菌、降解酶的發(fā)酵降解作用，還可實現(xiàn)對多批次禽畜糞便快速連續(xù)發(fā)酵的目的，提高禽畜糞便的堆肥發(fā)酵效率，對于推動了生物肥料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。

4 結 語

規(guī)模化養(yǎng)殖使我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化煥發(fā)生機，但大量的禽畜糞便也帶來令人擔憂的環(huán)境問題，如何正確利用這些錯配的資源，變廢為寶，讓環(huán)境污染問題得到解決又能發(fā)展新農(nóng)村經(jīng)濟，提高農(nóng)民生活質(zhì)量有重要意義[12]。禽畜糞便作為一種優(yōu)質(zhì)有機肥，有學者應用高效菌種發(fā)酵進行無害化處理，轉(zhuǎn)變成飼料、有機肥等進行利用[13]。但在堆肥開始階段，接種的降解菌需適應堆肥環(huán)境，重新調(diào)整其小分子和大分子的組成，此時降解菌對外界理化因子的抵抗力較弱，產(chǎn)酶效率低下，禽畜糞便堆肥開始階段的熟化速度較慢，禽畜糞便的堆肥時間長，不利于大規(guī)模、多批次連續(xù)處理禽畜糞便。本研究開發(fā)的禽畜糞便連續(xù)堆肥發(fā)酵流動床的工藝，通過預先制備發(fā)酵引物，發(fā)酵引物中含有大量的成熟的發(fā)酵菌且富含發(fā)酵菌生長、增殖的營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子等，與待發(fā)酵的禽畜糞便混合后，使待發(fā)酵的禽畜糞便具備了一定的適合發(fā)酵菌大量繁殖的生長環(huán)境，添加發(fā)酵菌劑在禽畜糞便中，經(jīng)過較短的延滯期就開始大量繁殖、產(chǎn)酶，能有效縮短禽畜糞便發(fā)酵堆肥的時間，在本研究中，加入發(fā)酵引物后堆肥熟化提前了4d，并且纖維素酶活力較對照組最大值約提高了31.7%，且一直保持在較高的水平，有助于降解過程的進行。熟化后的禽畜糞便作為發(fā)酵引物，與后續(xù)批次的待發(fā)酵禽畜糞便混合，使后續(xù)批次的待發(fā)酵禽畜糞便形成適合發(fā)酵菌大量繁殖的生長環(huán)境，實現(xiàn)禽畜糞便的連續(xù)發(fā)酵堆肥，有效提高了禽畜糞便的堆肥發(fā)酵效率。此外，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)微生物發(fā)酵處理能消除禽畜糞便臭味，減少有害氣體排放，有助于提高有機肥的品質(zhì)。在禽畜糞中添加秸稈、落葉等調(diào)理劑和泥炭、肥土等吸附劑的方式也可以提高堆肥效率[4]，我們的工作中添加了稻殼粉用以調(diào)節(jié)含水量，讓微生物發(fā)酵處于適宜的環(huán)境。因此根據(jù)微生物的特性以及選擇合適的微生物群進行配比，合理使用添加劑，并結合不同的生物堆肥處理方法的優(yōu)勢進行創(chuàng)新，在加快堆肥的熟化過程，提高有機肥的利用率，生產(chǎn)綠色有機肥減輕環(huán)境污染等方面有重要意義。