楊志業(yè)　方竑　譚穎儀　劉昂　趙玉洋　袁媛

【摘 要】 目的：考察烏梢蛇PCR快檢試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性等參數(shù)，并對試劑盒的應(yīng)用進行評價。方法：通過考察烏梢蛇PCR快檢試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、檢測限等性能參數(shù)，并采用與“藥典法”進行比較，考察試劑盒對136批市售烏梢蛇樣品檢測結(jié)果的準確性，進而對烏梢蛇PCR快檢試劑盒進行評價。結(jié)果：烏梢蛇PCR快檢試劑盒最低檢測樣品量為4mg，陽性結(jié)果準確率為93.4%，陰性結(jié)果準確率為95%，假陽性率為5.0%，假陰性率為6.6%。試劑盒特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。結(jié)論：烏梢蛇PCR快檢試劑盒操作簡單、快速，可用于現(xiàn)場快檢。

【關(guān)鍵詞】 烏梢蛇;PCR快檢試劑盒;應(yīng)用;評價

【中圖分類號】R282.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0073-04

Application and Evaluation of Zaocys PCR Rapid Testing Kit

YANG Zhiye1 FANG Hong1 TAN Yingyi1 LIU Ang1 ZHAO Yuyang2 YUAN Yuan2

1.Guangdong Institute for Drug Control， Guangzhou 510663， China;

2.China Academy of Chinese Medical Sciences， National Resource Center for Chinese Materia Medica， Beijing 10070， China

Abstract：Objective To explore the specificity， repeatability and stability of Zaocys PCR Rapid Testing Kit; and to evaluate its application. Methods By analyzing the indexes including specificity， repeatability， stability and the limit of detection of Zaocys PCR Rapid Testing Kit， studying its application to 136 batches of commercial samples by comparing the results from the rapid testing kit and from PCR method adopted by Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）， to evaluate the rapid testing kit. Results The lowest limit of detection was 4 mg. The percentage rate of accuracy of positive results and negative results were 93.4% and 95%; false-positive rate and false-negative rate were 5.0% and 6.6%. The results of specificity， repeatability and stability tests were pleased. Conclusion The Zaocys PCR Rapid Testing Kit is simpler and more rapid compared with the pharmacopoeia method and could be adopted for rapid testing on field.

Keywords：Zaocys; PCR Rapid Testing Kit; Application; Evaluation

烏梢蛇首載于南北朝《雷公炮炙論》[1-2]，其后歷代本草多有記載，尤以明代李時珍《本草綱目》的記載最為詳盡，在我國已有幾千年的藥用歷史。歷版藥典規(guī)定烏梢蛇為游蛇科動物烏梢蛇Zaocys dhumnades Cantor 除去內(nèi)臟的干燥體，具有祛風、通絡(luò)、止痙的功效。在現(xiàn)代臨床上，烏梢蛇廣泛用于治療皮膚瘙癢癥、白癜風、牛皮癬等，如烏蛇止癢丸、白癜風丸等[3]。烏梢蛇養(yǎng)殖成本較高，其商品主要為野生。隨著野生動物保護力度的進一步加強，烏梢蛇市場資源短缺，價格顯著上漲，為了牟取暴利，市場上出現(xiàn)了多種烏梢蛇偽品或混淆品[4]。

傳統(tǒng)鑒別方法多以蛇頭、腹鱗、體背鱗、肛鱗及尾下鱗的特征作為主要鑒別點[5]，但專業(yè)性要求高，而且經(jīng)去頭及鱗片后切制或酒制等炮制加工的飲片，鑒別難度大，無法滿足對市售烏梢蛇質(zhì)量控制的要求。中國藥典自2010年版始收載了聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測法對烏梢蛇進行鑒別，該法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合更為準確、可靠[6-9]。但經(jīng)典PCR法對實驗環(huán)境、操作人員要求高，常規(guī)裂解過程耗時長、步驟多，至少需要3.5h才能完成單次檢驗，無法適應(yīng)當前中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場運用的需要。為了獲得一種快速、準確、高效的鑒別烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒?，陳康等[10]通過對經(jīng)典PCR技術(shù)方法條件進行優(yōu)化，采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA[11-12]，提取過程無需使用離心機，采用SYBR Green I熒光檢視[13]代替瓊脂糖凝膠電泳，無需使用電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)等儀器，將烏梢蛇PCR鑒別方法試驗時間縮短為30min，并研制為快檢試劑盒，為實現(xiàn)中藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用奠定了基礎(chǔ)[14]。

《中國人民共和國藥品管理法》第一百條中規(guī)定：“對有證據(jù)證明可能危害人體健康的藥品及其有關(guān)材料，藥品監(jiān)督管理部門可以查封、扣押，并在七日內(nèi)作出行政處理決定”，藥品質(zhì)量快速篩查方法及產(chǎn)品就是為了在監(jiān)督現(xiàn)場對樣品進行快速分析，為藥品監(jiān)管部分及時提供“證據(jù)”，使對大眾身體或財產(chǎn)具有較大危害性的藥品得到提前控制。因此，為更好地開展現(xiàn)場快檢快篩，提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率，有必要對快檢產(chǎn)品進行評價，為藥品監(jiān)管部門的選擇和使用提供依據(jù)。筆者通過分析烏梢蛇PCR快檢試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、檢測限等性能指標，以及通過與“藥典法”對比，通過對136批市售樣品的檢測，考察試劑盒檢測結(jié)果的準確率、假陽性率和假陰性率，進而對烏梢蛇PCR快檢試劑盒進行綜合評價，為同類快檢產(chǎn)品的評價提供案例。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 MM400珠式組織細胞破碎儀（RETSCH）;BIORAD T100 PCR儀（BIORAD）;eppendorf centrifuge5481 離心機（EPPENDORF）;CAMAG REPROSTAR3薄層色譜照相裝置（CAMAG）;Sub Cell GT水平電泳系統(tǒng) （BIORAD）;Molecular Imager Gel DocTM XR+ Imaging System 全自動凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD）;DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 烏梢蛇PCR快檢試劑盒（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司）; Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（Takara公司）;蛋白酶K（Promega 公司）;Takara Ex Taq（Takara公司）;DNA 分子標記（100-1000bp，Takara公司）;中國藥典2015年版烏梢蛇藥典法引物（Invitrogen公司合成）; Agarose G-10瓊脂糖（Biowest）;電泳緩沖液配制試劑EDTA、Tris為分子生物學(xué)級試劑，冰醋酸為分析純。

樣品分為2類，一類是對試劑盒的性能進行考察的樣品，樣品信息見表1，樣品均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷教授鑒定;另一類是對試劑盒的應(yīng)用進行評價的樣品，收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機構(gòu)、藥材市場等，包括市售烏梢蛇粉12批（編號為WS-F001～WS-F012）;市售烏梢蛇飲片29批（編號為WS-S001～WS-S029）;市售酒烏梢蛇42批（WS-J001～WS-J042）;烏梢蛇藥材樣品3批（蛇鲞，編號為WSZ001～WSZ003）;烏梢蛇偽品50批（編號為SL001～SL050），包括烏梢蛇常見偽品灰鼠蛇、滑鼠蛇、赤鏈蛇等。

2 方法

2.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測 參考2015年版中國藥典三部生物診斷試劑盒的要求，對試劑盒的特異性、檢測限、重復(fù)性等性能進行考察。

2.1.1 特異性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各2批，灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各2批，分別采用試劑盒進行檢測。

2.1.2 檢測限 取WS1，分別取25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5 mg、4 mg、3 mg、2 mg、1 mg，分別采用試劑盒進行檢測。

2.1.3 重復(fù)性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各1批，灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各1批，在同一實驗室相同條件下，由3位實驗員采用同批次試劑盒分別進行試驗，考察批內(nèi)重復(fù)性。同時由同一位實驗員分別采用3個不同批次試劑盒進行檢測，考察批間重復(fù)性。

2.1.4 穩(wěn)定性 隨機選取一個試劑盒，分別放置至溶解，再分別按保存條件保存，如此反復(fù)分別經(jīng)過 1、5、10次后，對試劑盒內(nèi)的DNA提取試劑，陰性對照、陽性對照進行檢測。

2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價 實驗人員分為2組，第一組采用中國藥典2015年版一部烏梢蛇項下收載的PCR法對136批樣品進行測定賦值，測定好后進行隨機編號，形成盲樣;由第二組采用PCR快檢試劑盒方法進行測定，獨立匯總檢測結(jié)果。通過比較兩個實驗室的相應(yīng)的結(jié)果進行分析，結(jié)果不一致的進行復(fù)測，計算烏梢蛇PCR快檢試劑盒的陽性結(jié)果準確率、陰性結(jié)果準確率、假陰性率、假陽性率等指標。

2.2.1 烏梢蛇聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）藥典方法 取樣品0.5 g，充分研磨使成粉末，取0.1 g，照中國藥典2015年版一部烏梢蛇飲片【鑒別】項下操作，簡稱為“藥典法”。

2.2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法分為A、B兩部分，A部分為提取總DNA所用的試劑及耗材，于2～8 ℃保存;B部分為PCR擴增部分所用的試劑及耗材，于-20 ℃下保存，簡稱“快檢試劑盒法”。具體操作如下：①取10～25 mg樣品粉末，使用堿裂解法提取總DNA，所提取DNA稀釋10倍作為供試品溶液。另分別取陽性對照品、陰性對照品各10～25mg，同法制成陽性對照品溶液和陰性對照品溶液。②PCR擴增：擴增體系為25 μL，包含預(yù)混反應(yīng)溶液24 μL，待測樣品或陽性、陰性對照DNA模板1 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性1 min;再進行28個循環(huán)反應(yīng)，條件為88 ℃變性10s，62 ℃退火并延伸10 s。以無菌雙蒸水作為空白對照，取1 μL，同法擴增得到空白對照PCR擴增產(chǎn)物。③檢視方法：在PCR擴增產(chǎn)物中加入2 μL溶液熒光染料（SYBR Green I）混勻，于紫外光（365nm）下檢測熒光。若顯示綠色熒光，則為陽性結(jié)果，即為烏梢蛇正品，反之則為陰性結(jié)果，即偽品。

3 結(jié)果

3.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測結(jié)果

3.1.1 特異性 采用快檢試劑盒法，烏梢蛇正品、偽品檢測結(jié)果均與標定值一致。如圖1所示。

3.1.2 檢測限 取WS1，按“2.1.2”進行試驗，結(jié)果本試劑盒方法檢出限為4 mg。

3.1.3 重復(fù)性 經(jīng)檢測，不同生產(chǎn)批號的快檢試劑盒測定的結(jié)果一致，不同操作人員的檢測結(jié)果亦一致，表明該試劑盒重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性 經(jīng)檢測，反復(fù)凍融1、5、10次后，經(jīng)試劑盒提取的供試品DNA測定結(jié)果一致，表明該試劑盒穩(wěn)定性良好。

3.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價結(jié)果 分別采用“藥典法”和“快檢試劑盒法”對市售烏梢蛇樣品86批（包括烏梢蛇粉12批、烏梢蛇飲片29批、酒烏梢蛇樣品42批，藥材樣品3批）以及偽品飲片50批進行檢測，結(jié)果見表2。結(jié)果不一致的批次經(jīng)復(fù)試，復(fù)試結(jié)果與初試結(jié)果一致。

以“藥典法”檢測結(jié)果為標準結(jié)果，測定陽性標準結(jié)果為76批，陰性標準結(jié)果為60批，“快檢試劑盒法”測得陽性結(jié)果為74批，陰性結(jié)果為62批，陽性結(jié)果準確率為93.4%，其中酒烏梢蛇樣品中有5個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陰性”，假陰性率為6.6%;陰性結(jié)果準確率為95.0%，其中烏梢蛇偽品樣品中有3個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陽性”，假陽性率為5.0%。

4 討論

4.1 試驗樣品的代表性 本研究用于考察烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價的樣品收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機構(gòu)、藥材市場等16家，樣品規(guī)格有烏梢蛇粉、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇、烏梢蛇藥材等不同狀態(tài)的樣品，覆蓋了流通領(lǐng)域中各種使用規(guī)格，其中正品76批，偽品60批，總批次數(shù)136批，具有較好的代表性。其中烏梢蛇市售樣品不合格率分別為11.6%，表明市售烏梢蛇質(zhì)量情況不容樂觀，開展現(xiàn)場快篩快檢技術(shù)和產(chǎn)品的應(yīng)用以進一步提高監(jiān)督效能十分必要。

4.2 試劑盒的性能評價 經(jīng)對試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性及檢測限等性能指標進行考察，結(jié)果表明該試劑盒的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，檢測限（最低取樣量）為4 mg。而“藥典法”在增加裂解時間的前提下，檢測限約為10 mg，因此與“藥典法”比較，該試劑盒的檢測限僅為“藥典法”的二分之一。對于烏梢蛇這類價格較為昂貴的品種，檢測限低既可減少檢測成本，同時對于常見的以拼接等制偽手段制成的樣品，可以多部位取樣及增加取樣個數(shù)，進一步提高監(jiān)督力度。

4.3 試劑盒的應(yīng)用評價 經(jīng)采用快檢試劑盒對136批樣品進行試驗，并與“藥典法”結(jié)果相比較，陽性結(jié)果準確率為93.4%，陰性結(jié)果準確率為95.0%，假陽性率為5.0%，假陰性率為6.6%，總體準確率為94.1%。對假陰性結(jié)果和假陽性結(jié)果進行分析，可能與檢視方法有關(guān)，由于烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用在擴增產(chǎn)物中加入熒光染料（SYBR Green I），混勻后在紫外光燈（365 nm）下檢視，熒光較弱的情況下可能會影響主觀判斷，造成假陰性或假陽性的結(jié)果。在這種情況下，可采用“藥典法”進行進一步確證。與“藥典法”相比，該試劑盒取樣量少，簡便快速，使用成本低，作為快速檢測產(chǎn)品，烏梢蛇PCR快檢試劑盒可在監(jiān)督現(xiàn)場進行大批量快檢初篩，為打擊烏梢蛇摻假、售假提供的有效的方法和工具，亦為監(jiān)督執(zhí)法贏得了時間。

綜上，研究以中國藥典2015年版一部烏梢蛇質(zhì)量標準項下收載的PCR鑒別方法作為對照，對烏梢蛇PCR快檢試劑盒的性能與應(yīng)用進行評價。烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA，基于快速PCR技術(shù)，以SYBR Green I熒光檢視代替瓊脂糖凝膠電泳，將檢測時間縮短至30min以內(nèi)。與藥典收載的PCR法相比，具有操作簡便、耗時短、檢測限低、經(jīng)濟實惠等優(yōu)勢。通過對136批烏梢蛇樣品及常見混偽品進行試驗，結(jié)果表明該試劑盒可用于監(jiān)督現(xiàn)場快速篩查，以提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率。本文亦為同類產(chǎn)品的應(yīng)用與評價提供了研究經(jīng)驗。

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（收稿日期：2020-05-03 編輯：陶希睿）

基金項目：廣東省食品藥品監(jiān)督管理局科技創(chuàng)新立項資助項目（2018TDZ02）;廣東省中醫(yī)藥局科研項目（20171040）;國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗技術(shù)重點實驗室資助（國藥監(jiān)科外函[2019]82號-24）。

作者簡介：楊志業(yè)（1981-），女，漢族，副主任中藥師，研究方向為中藥鑒定與質(zhì)量評價。E-mail： yzye2004@126.com