榮雪路，魏榮榮，王鉅華，李甜甜，朱國強，丁國偉*

(1.揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司，江蘇 揚州 225000；2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225000)

星狀病毒主要引起鵝發(fā)生嚴重的內(nèi)臟型痛風(fēng)和關(guān)節(jié)型痛風(fēng)[1]。該病毒主要侵害2～25日齡的雛鵝，鵝感染后臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振、采食減少、消瘦衰弱、呼吸困難、行動遲緩和排白色稀便。剖檢可見：雙腎腫大，有尿酸鹽沉積，嚴重的呈大理石樣；其他內(nèi)臟被一層白色石灰樣薄膜包裹，關(guān)節(jié)周圍及關(guān)節(jié)腔有白色尿酸鹽沉積[2-3]。發(fā)病時間多為每年的11月到次年的5月，這個季節(jié)是我國中東部種鵝產(chǎn)蛋高峰期，其他時間發(fā)病較少。感染鵝的病死率受感染日齡、繼發(fā)感染等因素影響，發(fā)病率最高可達50%[4]，該病已經(jīng)成為危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的一種重要傳染病。目前，接種疫苗是預(yù)防、控制甚至消滅鵝星狀病毒的主要措施之一。星狀病毒的培養(yǎng)較為困難，限制了常規(guī)弱毒疫苗和滅活疫苗的研發(fā)。2009年，Sellers等[5]成功表達了雞星狀病毒的衣殼蛋白，用其免疫的雞群產(chǎn)生了高水平的抗體，表明衣殼蛋白有可能作為星狀病毒的亞單位疫苗。亞單位疫苗不含星狀病毒的核酸物質(zhì)，安全性較好，給鵝接種后不會發(fā)生持續(xù)感染或潛伏感染，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與星狀病毒的野毒株感染相區(qū)分，有利于疫病的控制和消滅。因此，研制一種生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高以及免疫效果好的鵝星狀病毒亞單位疫苗的生產(chǎn)方法具有重要的現(xiàn)實意義。

本試驗為有效預(yù)防鵝感染鵝星狀病毒，通過制備鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗，對種鵝進行接種，并對其所產(chǎn)鵝蛋孵出的雛鵝進行攻毒，研究該疫苗的保護效果，為鵝場鵝的健康和經(jīng)濟效益提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 種毒來源

分離并鑒定臨床病料，將所得病毒命名為鵝星狀病毒GoAsV-LH株，用鵝胚尿囊液傳代，取F3代用于攻毒(尿囊液病毒含量104.03ELD50/0.2 mL)。

1.1.2 試驗動物

試驗所用動物為四季鵝。

1.1.3 主要試劑及儀器

瓊脂購自Sigma公司，批號為WXBC9850V。生化培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號為LRH-150F。

1.1.4 試驗用疫苗

鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗由本公司提供，批號分別為rCapsid-001P、rCapsid-002P 和 rCapsid-003P，各批次疫苗抗原蛋白濃度為75 μg/mL。

1.2 疫苗性狀檢驗和無菌檢驗

按現(xiàn)行《中國獸藥典》[13]附錄進行疫苗性狀檢驗和無菌檢驗。

1.3 安全性檢驗

取3～5日齡雛鵝、7月齡開產(chǎn)種鵝各10羽，接種鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗，雛鵝每羽胸部肌肉注射0.2 mL，種鵝每羽胸部肌肉注射1 mL，每組均另取10羽相同來源、相同日齡的鵝，作為對照組。接種疫苗后7 d、14 d和21 d，每組取3羽鵝進行剖檢，檢查注射部位疫苗吸收情況和病理變化。

1.4 免疫效力試驗

將三批四季種鵝分為免疫組和對照組，在開產(chǎn)前5周，給免疫組種鵝接種三批鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗中的一批疫苗，接種劑量為1 mL/羽，對照組的種鵝不接種疫苗。接種后第2周至第4周，各組隨機取20羽鵝采集血液，采用瓊脂擴散試驗法檢測GoAs抗體；收集接種疫苗后第4周至第5周種鵝所產(chǎn)鵝蛋，每組40枚，其中10枚采用瓊脂擴散試驗法檢測GoAs抗體，余下的30枚放入38 ℃孵化箱中孵化。29 d～30 d后，各組任選20羽雛鵝，做好區(qū)分，飼養(yǎng)至 3日齡，采集雛鵝血液，分離血清，采用瓊脂擴散試驗法檢測GoAs抗體。同時進行攻毒試驗，用GoAsV-LH株F3代攻毒(尿囊液中病毒含量為104.03ELD50/0.2 mL)，每羽雛鵝口服0.5 mL，頸部皮下注射0.5 mL，每組攻毒10羽，剩余為對照組。各組鵝均分別隔離飼養(yǎng)，觀察14 d，記錄發(fā)病、死亡及保護情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗性狀檢驗和無菌檢驗結(jié)果

三批疫苗均為乳白色油包水型乳劑。用清潔吸管吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴散。將疫苗加入10 mL離心管中，以3 000 r/min離心15 min，管底析出水相未超過0.5 mL。無菌檢驗未發(fā)現(xiàn)菌落生長。

2.2 疫苗安全性檢驗結(jié)果

鵝群注射疫苗后，連續(xù)21 d，各組鵝的精神狀況、飲水和進食量均良好；免疫后 7 d、14 d和21 d，觸摸檢查試驗組鵝注射部位無紅腫等局部注射反應(yīng)；剖檢注射部位，發(fā)現(xiàn)疫苗吸收良好，無病理變化。

2.3 鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗的免疫效力

2.3.1 種鵝接種疫苗后血清抗體檢測結(jié)果

試驗組鵝接種三批疫苗28 d后，用鵝星狀病毒瓊脂擴散法測得的抗體效價平均值均不低于3.6log2，對照組鵝的抗體均為陰性，具體結(jié)果見表1。

2.3.2 接種疫苗的種鵝4～5周內(nèi)所產(chǎn)鵝蛋卵黃抗體檢測結(jié)果

試驗組鵝接種三批疫苗后4～5周內(nèi)任取10枚鵝蛋，其卵黃瓊脂擴散法GoAsV抗體效價平均值均不低于3.0log2，對照組的10枚鵝蛋卵黃瓊脂擴散法GoAsV抗體均為陰性，結(jié)果見表2。

2.3.3 3日齡雛鵝血清抗體檢測結(jié)果

接種三批疫苗被的試驗組鵝所孵3日齡雛鵝的血清瓊脂擴散法GoAsV抗體效價平均值均不低于2.7log2，對照組均為陰性，結(jié)果見表3。

2.3.4 3日齡雛鵝被動免疫攻毒試驗

接種三批疫苗的試驗組鵝所產(chǎn)種蛋孵出雛鵝在3日齡攻毒后采食、飲水和精神狀態(tài)均正常，未出現(xiàn)鵝星狀病毒臨床感染癥狀，攻毒后14 d，每組均100%(10/10)健活。對照組鵝所產(chǎn)種蛋孵出的雛鵝攻毒后第3天開始出現(xiàn)精神沉郁、厭食、站立不穩(wěn)、離群、排稀灰白色或黃綠色糞便等癥狀，攻毒后第5天死亡，攻毒后10 d共死亡5羽雛鵝。剖檢病死鵝發(fā)現(xiàn)，跖、跗和趾關(guān)節(jié)腫大，皮下有大量尿酸鹽；整個心臟和部分肝臟出現(xiàn)石灰樣尿酸鹽沉積；腎臟腫大，充血，表面布滿石灰樣尿酸鹽沉積；肺臟表面散布尿酸鹽沉積；腺胃散布尿酸鹽沉積；脾臟出血嚴重，有灰白色壞死灶。被動免疫攻毒結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 鵝星狀病毒感染及防疫措施

2017年以來，全國各地的鵝群廣泛發(fā)生以內(nèi)臟型痛風(fēng)和關(guān)節(jié)型痛風(fēng)為主要癥狀的傳染性疾病，主要侵害2～25日齡的雛鵝，死亡率最高可達50%[4]，已經(jīng)成為危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展一種重要傳染病。據(jù)文獻報道，高鈣高蛋白質(zhì)型日糧或鈣磷比例失調(diào)，可以導(dǎo)致雞痛風(fēng)發(fā)生[6]，因此，在防治雛鵝痛風(fēng)的問題上，有研究人員嘗試降低飼料中的蛋白質(zhì)含量[7-9]、添加青飼料等，但是收效甚微。姜曉寧等[10]在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，新型鵝星狀病毒是導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的主要原因，他們在采集的數(shù)百份病料中成功分離出星狀病毒，且檢出率高達96.5%[11]。目前，疫苗接種是預(yù)防、控制甚至消滅鵝星狀病毒的主要措施之一。星狀病毒的培養(yǎng)較為困難，限制了常規(guī)弱毒疫苗和滅活疫苗的研發(fā)。Sellers等[5]用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了雞星狀病毒的衣殼蛋白，接種種雞能夠刺激機體產(chǎn)生高水平的抗體，并可經(jīng)卵黃將抗體傳遞至后代維雞[12]。亞單位疫苗中的類病毒樣顆粒疫苗(Virus Like Particles，VLPs)不含星狀病毒的核酸物質(zhì)，安全性較好，接種后不會引發(fā)持續(xù)感染或潛伏感染，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與星狀病毒野毒株感染相區(qū)分，有利于疫病的控制和消滅。

3.2 鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗的免疫效力

本試驗克隆、擴增了Capsid蛋白全基因，利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建表達該抗原蛋白的重組桿狀病毒GoAsV/Bac株，在昆蟲細胞HF中高效表達抗原蛋白；該蛋白經(jīng)過提取純化和二乙烯亞胺滅活后被加入佐劑乳化制成亞單位疫苗。疫苗性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗合格后，將所制疫苗分三批次接種種鵝。應(yīng)用瓊脂擴散試驗法檢測鵝血清中的GoAs抗體，收集接種后5周內(nèi)所產(chǎn)的鵝蛋，再用瓊脂擴散試驗法檢測鵝蛋卵黃中的GoAs抗體。種蛋孵化后收集雛鵝，飼養(yǎng)至3日齡，用瓊脂擴散試驗法檢測雛鵝血清中的GoAs抗體，并攻毒。結(jié)果表明，三批疫苗接種后28 d，各試驗組種鵝血清中GoAsV抗體效價平均值均不低于3.6log2，所產(chǎn)種蛋卵黃中GoAsV抗體效價平均值均不低于3.0log2，孵出的雛鵝血清GoAsV抗體效價平均值均不低于2.7log2；對照組種鵝血清和種蛋以及所孵出的雛鵝血清中抗體均為陰性。試驗組雛鵝攻毒后一切正常，存活率100%，無不良臨床癥狀。對照組雛鵝攻毒后第3天開始出現(xiàn)精神沉郁、厭食、站立不穩(wěn)、離群和排稀灰白色或黃綠色等癥狀，存活率50%。死亡鵝剖檢可見：關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)內(nèi)和內(nèi)臟表面有石灰樣尿酸鹽沉積，腎臟腫大和充血，脾臟出血嚴重，有灰白色壞死灶。由此可見三批次疫苗對種鵝具有很好的免疫效果，雛鵝出雛時血清中含有較高水平的GoAsV抗體，可以有效抵抗鵝星狀病毒的攻擊。

4 結(jié)論

鵝星狀病毒亞單位疫苗可以有效預(yù)防鵝星狀病毒的感染，免疫效果良好。