肖寶華，廖寶林，王 瓊，謝子強(qiáng),2，謝勇琪，覃業(yè)曼

(1.廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東 深圳518000；2.深圳市碧海藍(lán)天海洋科技有限公司，廣東 深圳518000)

0 引言

造礁石珊瑚(刺胞動(dòng)物門Cnidaria珊瑚綱Anthozoa六射珊瑚亞綱Hexocorallia石珊瑚目Scleractinia)組成的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是海洋環(huán)境中物種最豐富的生態(tài)群落之一[1]，主要分布在地球南北緯30°以內(nèi)的海域[2]2.以往的研究中，多采用珊瑚骨骼形態(tài)、顏色、觸手等依據(jù)構(gòu)建珊瑚分類體系并對(duì)珊瑚進(jìn)行分類[3].其中，石珊瑚(Scleractinian)多以珊瑚骨骼形態(tài)為依據(jù)進(jìn)行分類[4]，[5]1893.但是，珊瑚骨骼變異性和同源性[6]640等研究中尚未攻克的難關(guān)阻礙了人們對(duì)珊瑚分類進(jìn)化的進(jìn)一步認(rèn)識(shí).隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展與珊瑚多樣性研究的不斷深入，分子生物學(xué)方法逐漸應(yīng)用于珊瑚的系統(tǒng)發(fā)育研究中，為珊瑚研究提供了新的思路.其中，基于不同算法模型建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也為研究珊瑚進(jìn)化關(guān)系提供新方法.20世紀(jì)90年代，科學(xué)家開始了石珊瑚的分子生物學(xué)研究[7]407.根據(jù)相關(guān)學(xué)者的分子生物學(xué)研究積累并結(jié)合已有的形態(tài)學(xué)研究，可以將造礁石珊瑚分為堅(jiān)實(shí)型類群(Robust)和復(fù)合型類群(Complex)[6] 641.堅(jiān)實(shí)型珊瑚被認(rèn)為是鈣化程度較高，具備堅(jiān)實(shí)的骨骼結(jié)構(gòu)，珊瑚外觀主要以碟片狀和團(tuán)塊狀為主的類群，包括蜂巢珊瑚科(Faviidae)、石芝珊瑚科(Fungiidae)和褶葉珊瑚科(Lobophyllidae)等[6] 641.復(fù)合型珊瑚骨骼鈣化程度較低，形態(tài)復(fù)雜多變，包括鹿角珊瑚科(Acroporidae)、菌珊瑚科(Agaricidae)和濱珊瑚科(Portidae)等[6] 641.同時(shí)，科學(xué)家在研究的過程中發(fā)現(xiàn)珊瑚蟲的線粒體基因進(jìn)化速度慢，相對(duì)保守[8].線粒體的12S rRNA基因、16S rRNA基因和細(xì)胞色素b基因、細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)等通常作為研究珊瑚系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化的標(biāo)記基因，其中，rRNA基因結(jié)構(gòu)保守，進(jìn)化速度緩慢，是研究生物進(jìn)化關(guān)系的典型特征基因[9] 460.

深圳市東部海域受亞熱帶季風(fēng)氣候的影響，年平均海水表面溫度(SST)為21.6 ℃，平均鹽度32，地表徑流較少且短，呈放射狀入海，海岸曲折，灘涂面積少，海洋底質(zhì)多為粘土和粉沙[10].優(yōu)越理想的自然條件使大鵬半島海域成為石珊瑚生長發(fā)育的溫床.大鵬半島海域的石珊瑚不但種類豐富，并且珊瑚覆蓋率較高，由石珊瑚形成的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是深圳生態(tài)基石的重要組成.2007年對(duì)深圳海域珊瑚資源進(jìn)行調(diào)查，共記錄了47種石珊瑚[11].近年來，由于受到氣候變暖、海洋酸化以及人類活動(dòng)的影響，全球珊瑚資源呈現(xiàn)退化的趨勢(shì)[12-13]，大鵬半島海域的石珊瑚覆蓋率也逐年下降.因此，本研究通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，以石珊瑚線粒體12S rRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)大鵬半島海域的16個(gè)石珊瑚樣品種間關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為深圳東部海域珊瑚資源保護(hù)工作提供相應(yīng)理論基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1 采樣站位及方法

供試的石珊瑚樣品采自深圳東部大鵬半島海域的6個(gè)站位(圖1)，具體經(jīng)緯度見表1.珊瑚樣品采于2018年7～8月，挑選風(fēng)平浪靜，海水透明度高的時(shí)候出海采樣.實(shí)驗(yàn)人員準(zhǔn)備好潛水和水下拍攝設(shè)備后，在相應(yīng)的站位下潛，剪取珊瑚邊緣斷枝(1～2 cm)并拍攝珊瑚樣品圖片和視頻，以便后期樣品的形態(tài)學(xué)鑒定.所采集的珊瑚樣品截取小部分于裝有無水乙醇的離心管中保存，用于后續(xù)提取樣品基因組總DNA.

圖1 深圳東部大鵬半島海域采樣站位圖

表1 深圳東部大鵬半島海域采樣站位信息表

1.2 樣品的形態(tài)學(xué)鑒定

樣品的形態(tài)學(xué)鑒定參照鄒仁林[2]19-235的《中國動(dòng)物志-腔腸動(dòng)物門·珊瑚蟲綱·石珊瑚目·石珊瑚》和Veron[5]1893-1894六射珊瑚骨骼形態(tài)特征分類系統(tǒng)，將所采集的珊瑚樣品依據(jù)珊瑚骨骼形態(tài)分為5科7屬9種，各樣品的形態(tài)學(xué)分類情況如表2所示.

表2 珊瑚樣品的形態(tài)學(xué)分類

1.3 樣品的基因組總DNA提取

采集的樣品使用濾紙吸附表面黏液并用工具搗碎，搗碎后的樣品使用DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)提取細(xì)胞組織基因組.提取獲得的DNA樣品在經(jīng)過凝膠電泳檢測(cè)后，置于4 ℃冰箱中貯藏備用.

1.4引物設(shè)計(jì)合成

12S rRNA基因的PCR引物采用文獻(xiàn)[14]的12S基因通用引物，并委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成.引物序列為：f-AGC CAC ACT TTC ACT GAA ACA AGG；r-GTT CCC YYW CYC TYA CYA TGT TAC GAC.采用升溫PCR擴(kuò)增，先以50 ℃退火5個(gè)循環(huán)接56 ℃退火的30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小為703～887 bp.

1.5 PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序

PCR反應(yīng)體系反應(yīng)(總體積為25 μL)：0×Buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；上下游引物各1 μL；Taq DNA聚合酶1 U；DNA模板2 μL；其余用去離子水補(bǔ)至25 μL.

PCR反應(yīng)條件：5 min預(yù)變性(95 ℃)，46 s變性(95 ℃)，46 s退火(50 ℃)，1 min 30 s延伸(72 ℃)，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g·L-1的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)，選取擴(kuò)增條帶單一、濃度較高的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，獲取各實(shí)驗(yàn)樣品的序列信息.

1.6 序列分析

測(cè)序所得序列用DNASTAR中的Editseq軟件進(jìn)行編輯、剪切、校正，再將校正好的序列與NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，以確保所獲得的序列為目標(biāo)序列.

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

采用MEGA6.0軟件進(jìn)行基因序列分析，獲取樣品12S rRNA基因組序列長度、堿基組成、簡約信息位點(diǎn)等相關(guān)信息，同時(shí)根據(jù)簡約信息位點(diǎn)，計(jì)算出種間遺傳距離.本研究中系統(tǒng)進(jìn)化樹是使用MEGA6.0軟件基于Kimu-ra雙參數(shù)模型，采用鄰位連接法(Neighbor-Joinning，NJ)、最小進(jìn)化法(Minimum-Evolution，ME)和最大似然法(Minimum-Likelihood，ML)構(gòu)建出來的.系統(tǒng)進(jìn)化樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信度水平由自引導(dǎo)值(Bootstrap value)估計(jì)，重復(fù)次數(shù)為1 000.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列堿基組成分析

通過擴(kuò)增測(cè)序，分別獲得16個(gè)石珊瑚樣品的12S rRNA的基因序列.從表3可知，本研究中的16條基因序列長度在692～830 bp之間.從堿基組成比例來看，16個(gè)石珊瑚樣品的12SrRNA序列的C含量在12.3%～15.5%之間，G含量在20.5%～24.3%之間，T含量在29%～31.8%之間，A含量最高，在31.8%～35.5%之間.所有序列堿基A、T的含量均高于G、C，具有明顯的AT偏倚.其中，Poriteslobata1與Poriteslobata2、Poriteslobat3序列堿基組成相同；Pavonadecussata1和Pavonadecussata3序列堿基組成相同；Acroporasp1、Acroporasp2、Acroporasp3、Acroporasp4和Acroporasp5序列堿基組成相同.

表3 16個(gè)石珊瑚樣品的12S rRNA基因片段的序列組成

2.2 序列變化情況及種間遺傳距離

通過MEGA6.0計(jì)算16個(gè)石珊瑚樣品的種間遺傳距離.從表4可知，16個(gè)樣品的平均距離為0.094 3.遺傳距離在科、屬、種間呈逐級(jí)遞減趨勢(shì).其中，五邊角蜂巢珊瑚(Favitespentagona)和十字牡丹珊瑚第2個(gè)樣品之間(Pavonadecussata2)的種間遺傳距離最大，為0.256 8.團(tuán)塊濱珊瑚的3個(gè)樣品(Poriteslobate1、Poriteslobate2、Poriteslobata3)間遺傳距離為0，根據(jù)形態(tài)學(xué)初步判定這3個(gè)樣品為同一種石珊瑚，序列堿基組成分析和種間遺傳距離分析數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一點(diǎn)；十字牡丹珊瑚樣品1(Pavonadecussata1)和十字牡丹珊瑚樣品3(Pavonadecussata3)遺傳距離為0，結(jié)合序列堿基組成和形態(tài)學(xué)分析，初步判定兩個(gè)樣品為同一種十字牡丹珊瑚；鹿角珊瑚的5個(gè)樣品(Acroporasp1、Acroporasp2、Acroporasp3、Acroporasp4、Acroporasp5)之間遺傳距離為0，通過序列堿基組成和形態(tài)學(xué)分析也可以判定這5個(gè)樣品為同一種鹿角珊瑚.據(jù)此，判定本研究的16個(gè)石珊瑚樣品來源于9種石珊瑚.排除遺傳距離為0的樣品，十字牡丹珊瑚樣品1(Pavonadecussata1)和十字牡丹珊瑚樣品2(Pavonadecussata2)間的遺傳距離最小，為0.001 5.

表4 基于12S rRNA基因的16個(gè)石珊瑚樣品種間遺傳距離

2.3 基于12S rRNA對(duì)九種石珊瑚的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA6.0軟件將9種石珊瑚的12S rRNA通過鄰位連接法、最大似然法和最小進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，只是在節(jié)點(diǎn)置信度上略有差異.由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖2)可知，這9種石珊瑚聚為2個(gè)大的分支：濱珊瑚科(Poritidae)、菌珊瑚科(Agariciidae)、鹿角珊瑚科(Acroporidae)和枇杷珊瑚科(Oculinidae)等復(fù)合型珊瑚聚為一簇；蜂巢珊瑚科(Faviidae)等堅(jiān)實(shí)型珊瑚聚類為一簇，這個(gè)結(jié)果與已有的珊瑚分類學(xué)研究結(jié)果相符合[7]397,[15]，上文種間遺傳距離分析中也能看出2個(gè)分支間的珊瑚種間距離值相較同一分支的科間、屬間、種間距離值較大.從聚類結(jié)果可見，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法劃分的各科親緣關(guān)系較近：同為濱珊瑚科(Poritidae)的柱角孔珊瑚(Gonioporacolumna)和團(tuán)塊濱珊瑚(Poriteslobata)親緣關(guān)系較近，聚為一支；同為菌珊瑚(Agariciidae)的兩種十字牡丹珊瑚(Pavonadecussata1、Pavonadecussata2)的12SrRNA序列存在細(xì)微差異，聚為一支；同為蜂巢珊瑚科(Faviidae)的角蜂巢珊瑚(Favitessp)和五邊角蜂巢珊瑚(Favitespentagona)聚為一支.鹿角珊瑚(Acroporasp)與翼形薔薇珊瑚(Montiporapeltiformis)聚為一支，叢生盔形珊瑚(Galaxeafascicularis)和其他復(fù)合型珊瑚親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

圖2 最大似然法構(gòu)建九種石珊瑚12SrRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹注：分枝上數(shù)值表示最大似然法、鄰接法與最小進(jìn)化法1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)的bootstrap值.

3 討論

本研究的石珊瑚樣品12S rRNA基因片段長度在692～830 bp之間，G+C含量在32.9%～38.9%之間，呈現(xiàn)明顯的AT偏倚.通過堿基組成分析、種間遺傳距離分析和形態(tài)學(xué)分析初步將本研究中的16個(gè)石珊瑚樣品分為9種，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹則將9種石珊瑚進(jìn)一步分為堅(jiān)實(shí)型珊瑚和復(fù)合型珊瑚兩簇.結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析和堿基組成分析可見，本研究中的蜂巢珊瑚的12S rRNA序列長度在692～694 bp之間，G+C含量在32.9%～33.4%之間；而復(fù)合型珊瑚這一分支的12S rRNA序列長度在798～830 bp之間，G+C含量在37.7%～38.5%之間，因此，本研究中的堅(jiān)實(shí)型珊瑚的蜂巢珊瑚和其余復(fù)合型珊瑚的12S rRNA在序列長度和G+C含量間有較為顯著的差別.但由于本研究中的實(shí)驗(yàn)樣品較少，此結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證.由本文研究結(jié)果可知，不同種屬間的石珊瑚12S rRNA序列差異較為明顯，同一種屬的石珊瑚也存在細(xì)微差異.十字牡丹珊瑚的2個(gè)樣品(Pavonadecussata1、Pavonadecussata2)根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定為同一種，但兩者的12S rRNA基因存在這差異，說明石珊瑚12S rRNA基因具備用于石珊瑚種間分化研究的潛力.

在石珊瑚分子生物學(xué)研究中多采用線粒體COI基因和16S rRNA等作為分子標(biāo)記基因.COI基因長度適宜、進(jìn)化速率慢并且富含系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，能夠較好地進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析[9]459.但也由于石珊瑚COI基因緩慢的進(jìn)化速率，導(dǎo)致石珊瑚COI基因較低的種內(nèi)分化，在種內(nèi)鑒定方面存在不足[16].16S rRNA基因也具備較為保守、進(jìn)化速率較慢的特點(diǎn)，適宜用作種以上分子分類的標(biāo)記，但在部分珊瑚科屬內(nèi)也存在著種間分化較低的問題[17].相較而言，12S rRNA的基因序列的長度較長、差異性較大并且能夠較好地鑒別珊瑚的種間的差異，能夠彌補(bǔ)COI基因和16S rRNA在分子鑒定方面的不足，可以較好地作為其他分子標(biāo)記研究的補(bǔ)充和佐證.