王 鑫，李 楠，齊佳慧，李曉輝，藺彬彬

(哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150086)

0 引 言

金銀花是藥食兩用型的中藥材，其主要成分中清熱解毒的活性物質(zhì)通常被認(rèn)為是有機(jī)酸綠原酸。近年來，利用回流法、超聲波法和微波法提取植物中有效成分被得到了廣泛的應(yīng)用及關(guān)注[1-4]。李杰等[5]用水熱法對提取金銀花中綠原酸的工藝進(jìn)行了研究。他們選取料液比、提取溫度及提取時(shí)間為控制因素，綠原酸提取率為評價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件。魏銳等[6]選取料液比、溫度、提取次數(shù)、時(shí)間為自變量，以綠原酸的得率為評價(jià)指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化杜仲葉中綠原酸的提取工藝。王省超等[7]用超聲波法來提取羅布麻茶中的綠原酸，分別改變料液比、超聲時(shí)間、超聲波功率和甲醇的濃度等，探究它們對綠原酸濃度的影響，并且設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了提取工藝，同時(shí)也將提取出來的綠原酸用高效液相色譜法測定其濃度。綠原酸被稱為“第七營養(yǎng)素型的”中的重要一員，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健行業(yè)[8-12]。本文旨在對比研究不同方法、多種因素對金銀花中綠原酸提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花藥材，購于黑龍江省藥材公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥ 98%)，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈(色譜純 99.9%)，購于美國 Tedia 公司；無水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)，購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 儀器

LC-10AT高效液相色譜儀(島津，日本)；C18色譜柱(島津，LC-C18 150×4.6 mm)；HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 金銀花提取液的制備

稱取0.500 g金銀花粉末于圓底燒瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(按照乙醇與水的體積比配制)，80 ℃回流2 h，過濾并轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min離心15 min，收集上清液，用乙醇定容至50 mL容量瓶；再取4 mL，定容至10 mL容量瓶，取適量溶液超聲、脫氣、過膜后，用高效液相色譜測其濃度。

1.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取2.0 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，50%甲醇定容，即制得濃度為40 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL定容至10 mL，得到濃度梯度為4 μg/mL、12 μg/mL、20 μg/mL、28 μg/mL、36 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液比對綠原酸濃度的影響

按照金銀花提取液制備的操作步驟，分別以料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，溶劑為55%乙醇溶液)、提取時(shí)間(0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h)、提取溫度(50 ℃，60 ℃，70 ℃，80 ℃，90 ℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%，55%，65%，75%，85%，95%)為水平，綠原酸濃度為因子，進(jìn)行提取率測定。料漿比對金銀花中綠原酸濃度的影響見圖1。

由圖1可見，回流法、超聲法其綠原酸的濃度隨著料液比的增大呈上升趨勢，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)均達(dá)到峰值。綠原酸在有機(jī)溶劑中易溶解，隨著提取劑乙醇加入量的增加，被提取物金銀花粉末與乙醇的接觸面積增大，綠原酸的濃度逐漸升高，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，綠原酸濃度達(dá)到飽和。此后，繼續(xù)增加乙醇的量，綠原酸的濃度會因金銀花粉末被稀釋而下降。因此，確定料液比為1∶40是提取金銀花中綠原酸的最佳比值。

圖1 料液比對金銀花中綠原酸濃度的影響Fig.1 Effect of material liquid ratio on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

2.2 時(shí)間對綠原酸濃度的影響

時(shí)間對金銀花中綠原酸濃度的影響見圖2。由圖2可見，隨著時(shí)間的增長，綠原酸濃度增大，回流法在提取時(shí)間為1 h時(shí)提取率達(dá)到最大。在2～2.5 h處，綠原酸的濃度緩慢增加，且增長幅度較小。而超聲法隨著時(shí)間增長，綠原酸的濃度先緩慢增大后減小，然后再增大，超聲時(shí)間為2 h時(shí)達(dá)到最大。超聲時(shí)間越長，越有利于金銀花中綠原酸的溶出。原因分析：最初綠原酸還未完全溶出，隨著提取時(shí)間的增長，綠原酸逐漸溶出，由于綠原酸的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，提取過程中，會發(fā)生異構(gòu)化而使其濃度降低。而超聲法比回流法更耗費(fèi)時(shí)間，從節(jié)能的角度考慮，回流法更優(yōu)。

圖2 時(shí)間對金銀花中綠原酸濃度的影響Fig.2 Effect of time on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸濃度的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對金銀花中綠原酸濃度的影響見圖3。由圖3可見，這兩種提取方法不同，得到的綠原酸濃度也不同，但大體趨勢是相同的。兩種方法在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)均為最大，之后，綠原酸濃度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先減小再增大。即使75%～85%時(shí)，綠原酸的濃度增大，但是它增大之后依舊沒有55%高，此后，濃度降低。雖然乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大有利于綠原酸的溶出，但當(dāng)它太大時(shí)，綠原酸溶出的同時(shí)也會溶出其他物質(zhì)，這些物質(zhì)可能與綠原酸產(chǎn)生共沉淀，從而使綠原酸的濃度降低。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)55%為提取金銀花中綠原酸的最佳值。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對金銀花中綠原酸濃度的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

2.4 溫度對綠原酸濃度的影響

溫度對金銀花中綠原酸濃度的影響見圖4。由圖4可見，回流法溫度為60 ℃時(shí)綠原酸濃度最大，此后，隨著溫度的增高提取率先減小再增大，其增大后程度均沒有60 ℃時(shí)的高。超聲法隨著溫度的升高，綠原酸的濃度逐漸增大，溫度為60 ℃時(shí)達(dá)到最大。原因分析：溫度過低，不利于金銀花中綠原酸的溶解；升溫，會加快金銀花分子擴(kuò)散，破壞金銀花結(jié)構(gòu)，使綠原酸可以更好的溶出。因綠原酸本身不穩(wěn)定，高溫會使其結(jié)構(gòu)里的羧酸基團(tuán)或鄰二酚基官能團(tuán)產(chǎn)生反應(yīng)，進(jìn)而使綠原酸濃度降低。因此，確定溫度為60 ℃時(shí)為提取金銀花中綠原酸的最佳值。

圖4 溫度對金銀花中綠原酸濃度的影響Fig.4 Effect of temperature on chlorogenic acid concentration in Honeysuckle

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波法雖然操作簡單，但存在提取時(shí)間長、提取率低等問題，而綠原酸分子結(jié)構(gòu)含有酯鍵、不飽和雙鍵、羧酸及苯環(huán)等不穩(wěn)定官能團(tuán)，溫度較高會使其分解，甚至可能會使其它物質(zhì)溶出，從而造成分離純化成本增加、提取率下降等影響?；亓鞣ň哂刑崛r(shí)間短、提取效率相對較高且綠原酸不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)。通過比較以上兩種提取方法，不論是飲用金銀花茶還是工業(yè)提取金銀花，回流法相對來說是最好的從金銀花中提取綠原酸的方法，同時(shí)確定了回流法的提取金銀花綠原酸的最佳提取條件。