黃星榞 隋明宇 侯文清 李明 陸穎 徐春華?

1) (中國科學(xué)院物理研究所, 北京 100190)

2) (中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

3) (蘭州大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730000)

1 引 言

DNA是生命體中重要的遺傳物質(zhì), DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯是細(xì)胞得以穩(wěn)定繁殖的基礎(chǔ).當(dāng)DNA受到細(xì)胞內(nèi)部或外部因素的威脅時, 會產(chǎn)生諸如DNA斷裂等結(jié)構(gòu)性損傷, 損傷嚴(yán)重時可導(dǎo)致癌變或細(xì)胞凋亡[1]. 細(xì)胞有一系列機(jī)制能夠修復(fù)這類損傷[2], 其中有一種以同源DNA為模板, 進(jìn)行嚴(yán)格而精確修復(fù)的方式, 稱之為同源重組. 同源重組由重組酶介導(dǎo)發(fā)生, 原核生物中的RecA和真核生物中的Rad51, DMC1是重組酶的代表, 它們在其他蛋白共同作用和促進(jìn)下開展同源重組過程.下面以本文的研究對象RecA重組酶為例對同源重組的過程進(jìn)行簡單說明：當(dāng)DNA的磷酸骨架斷裂, 首先RecBCD會處理斷鏈末端, 沿一定方向剪切DNA斷鏈位置, 暴露出一段有3’末端的單鏈.在腺苷三磷酸(ATP)存在時, RecA與單鏈DNA形成核蛋白絲結(jié)構(gòu) (nucleoprotein filament), 搜尋游離雙鏈DNA上的同源序列并進(jìn)行同源匹配, 匹配成功后核蛋白絲入侵雙鏈DNA并進(jìn)行鏈交換形成三鏈復(fù)合體. 最后由RuvABC處理三鏈復(fù)合體, 完成同源重組. 除了修復(fù) DNA 的損傷, 保證遺傳信息的穩(wěn)定性, 同源重組也能促使同源染色體上的同源堿基互換, 引入基因多樣性促進(jìn)生物更快適應(yīng)環(huán)境的變化.

RecA蛋白是大腸桿菌中recA基因的表達(dá)產(chǎn)物, 分子量 38 kD, 共含有 383 個氨基酸殘基. RecA蛋白的中心區(qū)域是包含240個氨基酸殘基的ATP水解酶核心, 除此之外, 還有帶30個殘基的N端和82個殘基的C端, N端和C端均帶有正電, 它們可以與DNA骨架發(fā)生相互作用. RecA蛋白上這兩處帶有大量正電的區(qū)域, 稱為第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn). 單鏈DNA與多個RecA單體的第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合, 形成具有周期螺旋結(jié)構(gòu)的核蛋白絲. 核蛋白絲中, 每個RecA單體能夠結(jié)合三個堿基形成基本結(jié)構(gòu)單元, 這三個堿基稱作一個triplet. 根據(jù)Chen[3]等的X射線晶體結(jié)構(gòu)結(jié)果, 一個triplet內(nèi)部的堿基間距為0.34 nm, 與B-DNA結(jié)構(gòu)中的堿基距離相同, 但兩個triplet的間距為0.78 nm, 核蛋白絲包裹的單鏈呈現(xiàn)拉伸狀態(tài), 平均的堿基間距為0.51 nm. 核蛋白絲的一個周期包含6.2個RecA單體和18.5個堿基, 呈右手螺旋結(jié)構(gòu). 在同源重組產(chǎn)生的三鏈結(jié)構(gòu)中, 我們稱核蛋白絲包裹的單鏈為入侵鏈(incoming strand), 同源雙鏈中與入侵鏈配對的鏈為互補(bǔ)鏈(complementary strand), 與入侵鏈序列相同的鏈為被置換鏈(outgoing strand).

同源重組過程中的序列識別和鏈交換的分子機(jī)制近年來一直是研究熱點(diǎn)[4?6], 而鏈交換的步長是鏈交換過程中的一個重要表象, 它可能會是鏈交換分子機(jī)制的一種體現(xiàn). 因而對鏈交換步長的測定是研究RecA分子機(jī)制的重要一環(huán). Ragunathan等[7]使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法,通過統(tǒng)計不同長度同源DNA鏈交換反應(yīng)完成的時間, 推算出鏈交換是以每步3 bp進(jìn)行的. Lee等[8]使用 DNA 簾 (DNA curtain)方法, 通過統(tǒng)計標(biāo)記熒光的DNA雙鏈在同源或錯配序列上的駐留時間, 計算出無論是RecA, Rad51還是DMC1體系,換鏈步長均是3 bp. 以3 bp為步長的說法很容易被人們接受, 因為一個RecA蛋白單體正好結(jié)合3 bp DNA, 但也有研究人員對步長提出其他看法.Prentiss課題組[9?12]參考核蛋白絲的晶體結(jié)構(gòu), 對鏈交換過程進(jìn)行了數(shù)學(xué)建模, 發(fā)現(xiàn)在鏈交換發(fā)生前的同源序列匹配過程中, 互補(bǔ)鏈處在能同時與入侵鏈和被置換鏈配對的位置, 當(dāng)配對長度為9 bp時體系處于最穩(wěn)定狀態(tài), 配對成功后發(fā)生換鏈, 同源序列識別和鏈交換均是以9 bp進(jìn)行的. 我們前期工作首次使用單分子磁鑷, 結(jié)合DNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)(DNA hairpin)的底物設(shè)計, 將反應(yīng)信號放大[13],直觀測量了鏈交換的反應(yīng)步長. 經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)每一步鏈交換的步長均為3 bp的整數(shù)倍, 其中最概然長度約為9 bp, 與Prentiss等的理論結(jié)果相同, 但與3 bp的結(jié)論矛盾. 磁鑷實驗可以得到最直觀的實驗結(jié)果, 但 9 bp的步長也可能是由 3個 3 bp構(gòu)成的,只是受到儀器的時間分辨率和空間分辨率的限制而沒有觀察到. 因此, 目前同源重組的鏈交換步長依然沒有定論. 我們認(rèn)為掌握了鏈交換的步長, 對于發(fā)掘同源識別和鏈交換的機(jī)制有著重要的意義,可以進(jìn)一步完善對同源重組過程的理解. 因此, 本文用一系列實驗來探索RecA介導(dǎo)的同源重組鏈交換步長, 以期從多方面、多角度驗證9 bp為鏈交換的最概然長度, 而非3 bp. 首先運(yùn)用酶切保護(hù)實驗, 證明了鏈交換的步長不是3 bp, 再使用單分子磁鑷測量了一定錯配程度序列下的換鏈總長度, 側(cè)面證實了鏈交換的步長為9 bp. 最后通過局域連續(xù)錯配序列, 再次證明鏈交換步長不是3 bp, 同時也分析了這9 bp內(nèi)錯配堿基的分布是如何對鏈交換造成影響的. 本文是使用單分子實驗對同源重組過程探究的新的嘗試, 運(yùn)用錯配堿基和酶切保護(hù)等手法, 為研究提供了新思路.

2 實驗材料、設(shè)計與操作

2.1 RecA、內(nèi)切酶及反應(yīng)溶液

RecA 蛋白購自 New England Biolabs (NEB)公司. 在磁鑷和熒光實驗中, 核蛋白絲的鏈交換反應(yīng)在 RecA reaction buffer中進(jìn)行, 具體成分為70 mM Tris-Ac (1 M=1 mol/L), 10 mM Mg(Ac)2,100 mM NaAc, pH=7.4. 為了保持核蛋白絲的穩(wěn)定, 每次進(jìn)液時需要額外補(bǔ)充 5 mM的ATPgS.酶切時使用了NEB公司的DNaseI內(nèi)切酶, 酶切環(huán)境為 DNaseI reaction buffer.

2.2 DNA的制備

磁鑷實驗中所使用的所有DNA序列均購自生工生物工程(上海)股份有限公司, 核苷酸鏈均稀釋在 TE buffer中. Hairpin DNA 的制備過程參考我們之前的工作[13].

2.3 磁鑷方法的原理和操作

磁鑷是一種單分子力譜方法, 可以通過追蹤磁球的高度直接觀測蛋白質(zhì)或DNA分子的結(jié)構(gòu)變化[13?17], 實驗中使用磁鑷結(jié)合 DNA hairpin結(jié)構(gòu),對鏈交換長度進(jìn)行直接測量. DNA hairpin是兩條具有回文序列的單鏈, 在小力下能夠自然退火形成B-DNA雙鏈. 用來代表同源重組過程中的互補(bǔ)鏈和被置換鏈. 鏈交換的發(fā)生導(dǎo)致互補(bǔ)鏈和被置換鏈打開, 根據(jù)打開的長度計算可計算鏈交換堿基數(shù).

首先將蓋玻片用丙酮/甲醇超聲清洗30 min,再浸泡在濃硫酸∶雙氧水體積比為7∶3配制的食人魚洗液中, 于 95 ℃ 水浴 2 h, 接著放置在 1% 的APTES 溶液中修飾 2 h, 具體步驟可參考[18]. 沖凈APTES后, 在1%的戊二醛溶液中修飾8 h, 取出沖洗吹干后密封保存. 在實驗前取出玻片, 用雙面膠和麥拉膜制成封閉的反應(yīng)池, 反應(yīng)池下表面用地高辛抗體修飾. 玻片的表面處理和鈍化可見參考文獻(xiàn)[19].

DNA連接完畢后, 將核蛋白絲加入到體系中使反應(yīng)進(jìn)行, 通過軟件記錄磁球位置和時間的關(guān)系, 繪制反應(yīng)曲線, 使用數(shù)據(jù)處理軟件收集換鏈長度等信息.

2.4 酶切保護(hù)實驗的原理和操作

酶切保護(hù)實驗涉及單分子熒光成像和酶切. 為了避免激光將反應(yīng)池內(nèi)所有熒光激發(fā), 增加實驗的背景噪聲, 使用TIRF場僅激發(fā)玻片幾百納米范圍內(nèi)的熒光分子[4], 通過軟件處理實驗圖像統(tǒng)計酶切前后熒光分子的數(shù)量.

實驗所用蓋玻片的清洗方法直到修飾APTES均與磁鑷相同, 在APTES處理后加入PEG鈍化玻片表面, 其中摻入1%的biotin-PEG用來與鏈親和素修飾的DNA進(jìn)行特異性鏈接. 玻片修飾完畢后制成反應(yīng)池, 連接單鏈DNA, 加入RecA單體和ATPgS共同孵育15 min制備核蛋白絲[20]. 隨后在體系中加入末端標(biāo)記Cy3熒光的雙鏈DNA.在打開激光錄像時加入抗淬滅體系延長熒光持續(xù)時間[20].

雙鏈?zhǔn)紫扰c核蛋白絲反應(yīng) 15 min, 15 min 內(nèi)大部分核蛋白絲都已參與反應(yīng). 隨后在反應(yīng)體系中加入DNaseI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理. 雖然ATPgS環(huán)境下鏈交換結(jié)束后核蛋白絲不易水解, 但為了保證核蛋白絲的穩(wěn)定性, 酶切時間不宜過長, 我們發(fā)現(xiàn)30 min的酶切已能產(chǎn)生明顯的對比效果, 因此酶切時間選定為30 min. 使用軟件對剩余熒光點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計數(shù). 對比酶切前后的熒光點(diǎn)數(shù), 可計算出發(fā)生完全鏈交換反應(yīng)的比例.

2.5 核蛋白絲的制備

磁鑷實驗中加入的核蛋白絲在反應(yīng)池外完成制備. 在RecA 反應(yīng)buffer中將RecA蛋白∶核苷酸以摩爾比1∶3的比例混合均勻, 隨后補(bǔ)充5 mM ATPgS, 在 37 ℃ 下孵育 5 min, 取出混合液后即可放入反應(yīng)池中進(jìn)行實驗. 在熒光實驗中, 核蛋白絲在反應(yīng)池中合成, 取 RecA 原液 2 μL, 與 100 μL的RecA 反應(yīng)buffer充分混合, 補(bǔ)充5 mM ATPgS后加入到反應(yīng)池中, RecA與反應(yīng)池中的單鏈DNA會自組裝形成核蛋白絲結(jié)構(gòu).

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 驗證鏈交換反應(yīng)是否以3 bp發(fā)生

首先要驗證的是鏈交換是否以3 bp進(jìn)行. Lee等[8,21]的 DNA curtain 實驗表明, 在 ATPgS條件下鏈交換可以跨過1個錯配堿基, 但會被兩個連續(xù)錯配堿基阻擋. 如果3 bp是換鏈的基本長度, 既然可以跨過一個錯配堿基, 那么如果每一個triplet內(nèi)都含有一個錯配堿基時, 也應(yīng)該可以成功換鏈.以此思路我們設(shè)計了帶有部分錯配堿基的DNA序列, 序列全長69個堿基, 前45個堿基為同源序列, 后24個堿基為33%錯配的序列, 錯配堿基均勻分布在每個triplet中, 即每個triplet包含一個錯配堿基, 如圖1(a)所示, 觀察鏈交換反應(yīng)是否可以跨過所有錯配. 同源序列長度大于18 bp, 滿足同源重組鏈交換反應(yīng)發(fā)生的條件[22]. 同源堿基提供DNA與核蛋白絲的初始反應(yīng)位點(diǎn)并促使換鏈反應(yīng)進(jìn)行, 形成三鏈結(jié)構(gòu).

熒光分子標(biāo)記在雙鏈中的互補(bǔ)鏈上, 位于錯配一端的末尾位置. 根據(jù)原子力顯微鏡結(jié)果[23], 在同源重組過程中, 如果鏈交換過程遇到阻礙, 剩余的雙鏈會以接近垂直的角度從核蛋白絲上脫離, 尾部暴露在外部環(huán)境中, 可以被內(nèi)切酶處理. 熒光分子隨著被水解的核苷酸鏈脫離三鏈結(jié)構(gòu), 熒光點(diǎn)數(shù)減少. 如果鏈交換反應(yīng)完全發(fā)生, 互補(bǔ)鏈與入侵鏈形成的雜合DNA被核蛋白絲包裹, 可以保護(hù)末尾的核苷酸不被水解, 熒光點(diǎn)數(shù)不變. 根據(jù)該原理設(shè)計了酶切保護(hù)實驗, 觀察核蛋白絲的鏈交換反應(yīng)能否容忍錯配堿基, 完成整條鏈的交換. 為了驗證核蛋白絲對酶切保護(hù)的效果, 使用了完全匹配的序列作為對照組, 示意圖如圖1(b)所示. 酶切實驗整體分為全匹配對照組和33%周期性錯配實驗組.

圖 1 全匹配酶切保護(hù)實驗的示意圖及酶切結(jié)果 (a) 包含錯配序列的酶切保護(hù)實驗示意圖, 藍(lán)色部分代表同源序列, 紅色部分代表錯配序列; (b) 在全匹配序列的情況下酶切保護(hù)實驗示意圖; (c) 酶切實驗結(jié)果, 分別為全匹配序列和33%錯配序列的酶切情況(誤差線代表統(tǒng)計誤差), 酶切時間為30 minFig. 1. The enzyme protection assay: (a) The diagram of the enzyme protection assay with mismatch sequence, blue strands represent homologous sequence and red strand represents mismatched sequence; (b) same as (a) when using completely homologous sequence;(c) the results of enzyme protection assay.

酶切保護(hù)實驗結(jié)果如圖1(c)所示, 在全匹配對照組實驗中, 酶切后熒光點(diǎn)數(shù)為酶切前的96%,基本沒有發(fā)生變化. 而33%錯配的實驗中, Cy3熒光點(diǎn)數(shù)在酶切后降為酶切前的19%, 說明鏈交換反應(yīng)在中途停止, 互補(bǔ)鏈和被置換鏈以B-DNA的形式脫離核蛋白絲, 暴露在溶液中的DNA末端被DNase I切除, Cy3分子脫離三鏈結(jié)構(gòu)擴(kuò)散到了溶液中, 導(dǎo)致熒光點(diǎn)數(shù)減少. 與對照組對比, 33% 錯配與全匹配的反應(yīng)現(xiàn)象完全不同, 錯配序列沒能像全匹配實驗一樣徹底完成鏈交換. 結(jié)果說明, 當(dāng)每個triplet內(nèi)平均分布一個錯配堿基時, 鏈交換過程無法克服錯配堿基帶來的阻礙而中止, 得到鏈交換可能不是以3 bp為步長發(fā)生的初步結(jié)論.

3.2 使用單分子磁鑷觀察不同錯配程度下的鏈交換長度

由于酶切保護(hù)方法只能驗證換鏈反應(yīng)是否完全進(jìn)行, 無法得到鏈交換終點(diǎn)的準(zhǔn)確位置, 觀測的現(xiàn)象有一定局限性. 我們使用磁鑷方法來定量測量33%錯配序列下的鏈交換停止的位置時[13], 意外得到了步長的信息. 磁鑷實驗的設(shè)計如圖2(a)所示. 為了保證信號的信噪比, 同時防止較大的力對DNA hairpin的穩(wěn)定性造成影響, 實驗中選擇了7 pN的拉力. 在使用錯配序列進(jìn)行實驗前, 先用全匹配序列驗證DNA長度變化與換鏈堿基數(shù)的對應(yīng)關(guān)系. 全匹配序列長度為69個堿基, 根據(jù)FJC模型[24,25]計算在7 pN下單鏈DNA的平均堿基間距為0.31 nm, 即hairpin岔口位置每有一個堿基完成鏈交換, 磁球升高 0.51+0.31=0.82 nm.全匹配序列的實驗結(jié)果如圖2(b)所示, 磁球的高度升高 57 nm, 根據(jù)換算對應(yīng)約 69 bp 的換鏈, 同源序列對照實驗說明長度與堿基的換算關(guān)系正確,接下來的磁鑷實驗同樣使用此對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行換算.

33%錯配實驗所用的DNA序列與酶切保護(hù)實驗的序列相同, 前45個堿基為同源序列, 后24個堿基為錯配堿基均勻分布的33%錯配序列, 定義第45個堿基位置為界面, 作為同源序列與錯配序列的分界線. 在ATPgS條件下, 假如換鏈沿著入侵鏈的 3'到 5'方向進(jìn)行, 即從 DNA hairpin岔口位置開始向另一側(cè)換鏈, 將得到如圖2(c)所示的實驗曲線. 對鏈交換信號處理后, 獲得了換鏈總長度的統(tǒng)計圖, 如圖2(d)所示. 從散點(diǎn)圖(圖2(d))可以看出, 換鏈總長度集中分布于界面位置, 少部分分布于界面之前 9 bp (–9)的位置, 說明在 33%錯配程度的情況下, 鏈交換反應(yīng)無法跨過錯配堿基, 導(dǎo)致鏈交換中止. 磁鑷方法定量的給出了換鏈總長度, 使我們發(fā)現(xiàn)了鏈交換完全無法跨過33%周期錯配序列這一新的現(xiàn)象. 如換鏈以3 bp為單位進(jìn)行, 結(jié)合鏈交換可以跨過1個錯配堿基的結(jié)論, 應(yīng)有部分反應(yīng)可以跨過界面, 但實驗結(jié)果顯示幾乎所有換鏈均停止在界面之前, 這與酶切保護(hù)實驗的結(jié)果是一致的, 說明鏈交換可能不是以3 bp為步長發(fā)生的. 而另一個鏈交換終點(diǎn)的峰值位于界面之前9 bp(–9), 說明這部分鏈交換被阻擋在了界面之前 9 bp, 而–9 到界面之間并沒有明顯的峰, 這很可能說明鏈交換的步長即為9 bp, 終點(diǎn)在–9位置的換鏈正好比終點(diǎn)在界面位置的換鏈少了一步.

圖 2 用磁鑷定量測量不同匹配程度序列下的換鏈長度 (a) 磁鑷實驗的示意圖, 紅色鏈代表錯配序列, 藍(lán)色鏈代表同源序列,從左到右分別對應(yīng)鏈交換反應(yīng)發(fā)生之前, 全匹配序列的鏈交換反應(yīng), 和鏈交換被錯配序列阻擋三種現(xiàn)象; (b) 全匹配序列下的換鏈曲線, 換鏈可以進(jìn)行到末尾; (c) 后 24 個堿基為部分錯配時的換鏈曲線, 紅色為界面位置; (d) 33% 錯配時的換鏈長度, 紅色實線代表界面位置, 紅色虛線為界面前9 bp的位置Fig. 2. Using magnetic tweezers to measure the strand exchange length under different periodic mismatch sequence: (a) From left to right are diagrams of experiments when strand exchange is not happened, strand exchange process under homologous sequence and periodic mismatch sequence, respectively. Red strands represent mismatch sequence and blue strands represent homologous sequence;(b) trace of fully homologous sequence; (c) trace of periodic mismatch sequence; (d) strand exchange length distributions of 33%periodic mismatch sequence, red line marks the interface and red-dashed line marks the position which is 9 bp before the interface.

上述現(xiàn)象說明核蛋白絲鏈交換的步長傾向于以 9 bp 發(fā)生而不是 3 bp, 與 Zhang 等[13]的實驗結(jié)果相符合. 結(jié)合同源比對過程是以9 bp進(jìn)行的理論結(jié)果, 推測在同源比對完成后, 緊接著發(fā)生了同樣長度的鏈交換. 至于界面到–9 bp之間的序列,完全匹配但是為什么仍然不進(jìn)行鏈交換, 還需更多的實驗來探究, 這可能涉及到同源識別和鏈交換更深層次的分子機(jī)理.

3.3 連續(xù)錯配堿基對換鏈的影響

前面的錯配實驗提示鏈交換步長傾向為9 bp而不是3 bp, 將錯配堿基由周期性均勻分布調(diào)整為局域連續(xù)分布. 實驗使用全長69個堿基的同源序列, 從第40號堿基開始, 插入3個連續(xù)錯配堿基, 通過磁鑷方法判斷鏈交換能否跨過不同長度的連續(xù)錯配堿基.

實驗?zāi)Ｐ蛨D如圖3(a)所示, 藍(lán)色部分為同源序列, 紅色部分為連續(xù)錯配堿基序列, 通過測量磁球高度的變化, 觀察鏈交換反應(yīng)能否跨過不同長度的局域錯配堿基. 為了更直觀地表現(xiàn)錯配堿基對鏈交換的影響, 使用柱狀圖統(tǒng)計了不同錯配堿基數(shù)時鏈交換能夠跨過界面位置的比例, 結(jié)果如圖3(b)所示, 同樣的反應(yīng)條件和濃度下, 假設(shè)全匹配的鏈交換事件發(fā)生的概率是100%, 所有的鏈交換行為可跨過2個連續(xù)錯配, 完全發(fā)生鏈交換反應(yīng); 7成的鏈交換行為可以跨過連續(xù)3個錯配堿基; 83%的鏈交換會被4個連續(xù)堿基阻擋, 停在界面之前. 當(dāng)連續(xù)錯配堿基數(shù)目為5個時, 鏈交換反應(yīng)則完全無法跨過錯配堿基.

連續(xù)3個錯配堿基的鏈交換結(jié)果進(jìn)一步說明了鏈交換的步長并非3 bp, 如果鏈交換的步長是3 bp,是沒有理由跨過100%錯配的triplet的. 同時, 如圖 3(c)所示, 當(dāng)鏈交換步長為 9 bp 時, 3 個錯配堿基的均勻分布和連續(xù)分布在9 bp內(nèi)的錯配程度同樣為33%, 卻表現(xiàn)了不一樣的結(jié)果. 對比二者的錯配堿基分布, 33%錯配序列中每3個堿基中有一個錯配堿基, 界面后的每個triplet均受到影響, 而3個錯配堿基影響的triplet數(shù)量有限, 所受影響的triplet數(shù)量對鏈交換有著重要影響.

圖 3 使用磁鑷方法探究換鏈?zhǔn)欠衲軌蚩邕^連續(xù)錯配堿基 (a) 磁鑷實驗的示意圖, 紅色線段位置為錯配堿基序列, 藍(lán)色線段為同源堿基序列, 從左到右分別是鏈交換反應(yīng)之前, 鏈交換被錯配堿基阻礙和鏈交換跨過錯配序列三種現(xiàn)象; (b) 不同連續(xù)錯配堿基數(shù)目時, 越過錯配堿基事件數(shù)量的百分比(誤差線代表統(tǒng)計誤差); (c) 33%錯配序列和連續(xù)3 bp錯配序列的堿基位置分布,N為錯配堿基數(shù)目, 紅色代表錯配堿基, 藍(lán)色代表同源堿基; (d)同(c)一樣, 用來表示N = 2, 4和5時的錯配堿基分布Fig. 3. Using magnetic tweezers to investigate if strand exchange could stride across continuous mismatch base pairs: (a) From left to right are diagrams of experiments when strand exchange is not happened, strand exchange process blocked by continuous mismatch base pairs and strand exchange process stride across continuous mismatch base pairs, respectively. Red segments represent mismatch base pairs and blue segments represent homologous base pairs; (b) across probability when facing different continuous sequence; (c) the mismatch base pairs distribution of 33% periodic mismatch sequence and 3 bp continuous mismatch sequence, N represents the number of mismatch base pairs; (d) same as (c) when N = 2, 4 and 5.

如圖3(d)所示, 隨著連續(xù)錯配堿基數(shù)量的增加, 9 bp范圍內(nèi)序列的同源度逐漸降低, 跨過錯配堿基的鏈交換事件減少, 較低的同源度給同源重組過程增加了阻力. 除此之外, 較多的連續(xù)錯配堿基也使受錯配堿基影響的triplet數(shù)量增加, 在低同源度和受影響triplet數(shù)量的共同作用下, 5個連續(xù)錯配堿基徹底使同源重組反應(yīng)中止. 實驗說明序列同源度和受影響的triplet數(shù)量均會對鏈交換產(chǎn)生影響, 但它們影響的具體機(jī)制和各自的影響效果還需要實驗進(jìn)一步探索.

4 討 論

本文結(jié)合了磁鑷和酶切保護(hù)的方法, 通過不同錯配序列的鏈交換實驗, 驗證了鏈交換的步長為9 bp的結(jié)論. 結(jié)合理論與實驗結(jié)果, 我們認(rèn)為在同源序列比對過程中, 同時檢測9 bp序列同源度時的自由能最低[26], 與鏈交換步長傾向于以9 bp發(fā)生存在關(guān)聯(lián). DNA在與核蛋白絲進(jìn)行同源比對時,被置換鏈與第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合, 第二結(jié)合位點(diǎn)提供的結(jié)合能, 使被置換鏈與互補(bǔ)鏈均能被劇烈拉伸,但該體系并非處在一個穩(wěn)定的狀態(tài), 趨向于發(fā)生鏈交換形成自由能更低的狀態(tài). 因此在同源比對成功后會緊接著發(fā)生鏈交換反應(yīng), 鏈交換的長度與同源比對長度相等, 均為 9 bp. 同時, 通過這些實驗還發(fā)現(xiàn)了均勻分布的錯配序列把鏈交換的終點(diǎn)擋在了界面之前9 bp, 這個現(xiàn)象可能與鏈交換的同源識別機(jī)制密切相關(guān), 但還需進(jìn)一步的實驗來探索.我們還發(fā)現(xiàn)錯配堿基的數(shù)量和分布都會對鏈交換產(chǎn)生影響, 簡單來說就是錯配程度越高, 錯配涉及的triplet數(shù)目越多, 越難發(fā)生鏈交換. 我們推測,錯配堿基數(shù)的增加使發(fā)生同源序列比對的9 bp內(nèi)堿基的同源度不斷降低, 互補(bǔ)鏈與入侵鏈形成雜合雙鏈所降低的自由能無法彌補(bǔ)因含有錯配堿基的兩條鏈形成雜合雙鏈產(chǎn)生的不穩(wěn)定性, 使鏈交換無法自發(fā)進(jìn)行. 相比于換鏈步長為3 bp的理論, 換鏈步長為9 bp的同源檢測機(jī)制可以容納更多的錯配堿基, 也能蘊(yùn)含更多的調(diào)控手段, 使同源重組過程具有更靈活的可控性, 從而使其對生物生存的有利程度最大化. 至于同源比對是如何整體考慮9 bp內(nèi)的錯配數(shù)量和分布, 從而決定是否換鏈, 其更深層次和更細(xì)致的機(jī)理, 可能會十分復(fù)雜, 還需設(shè)計更多的實驗來得到確切的結(jié)論. 至于其他人3 bp鏈交換步長的研究結(jié)果, 也不能說是完全錯誤的.我們認(rèn)為3 bp應(yīng)該是基本的結(jié)構(gòu)單位, 而9 bp是主要的功能單位, 亦或是有更深層的分子機(jī)制可以將3 bp與9 bp的結(jié)果統(tǒng)一起來, 這些都需要進(jìn)一步的實驗去證實.

在實驗中使用酶切保護(hù)實驗驗證鏈交換反應(yīng)是否完全進(jìn)行, 使用了磁鑷觀測鏈交換堿基數(shù)的方法, 并通過改變堿基序列進(jìn)一步發(fā)掘了同源重組的鏈交換機(jī)制. 酶切保護(hù)實驗看到的現(xiàn)象有限, 但是實驗數(shù)據(jù)量多, 適合對猜想進(jìn)行提前驗證; 磁鑷實驗數(shù)據(jù)量少但觀測的現(xiàn)象豐富, 可以作為實驗的主要研究方法. 兩種手段相輔相成, 二者亦可結(jié)合起來, 拓寬實驗設(shè)計的范圍, 得到新的信息, 進(jìn)一步推動同源重組過程的研究.

5 結(jié) 論

本文使用酶切保護(hù)實驗證明了同源重組鏈交換的步長可能不為3 bp, 用單分子磁鑷方法, 通過周期性錯配序列, 驗證了同源重組的鏈交換步長傾向為9 bp. 通過連續(xù)錯配序列, 也傾向于否定步長為3 bp的說法, 同時還發(fā)現(xiàn)了9 bp內(nèi)序列的同源度和錯配堿基的分布共同對鏈交換造成影響. 得到以上結(jié)論的同時, 我們也得到很多啟示, 提示同源重組分子機(jī)理的復(fù)雜性. 這些尚不能解釋的現(xiàn)象促使我們設(shè)計更多的實驗來一步步深入探索, 逐步解開同源重組分子機(jī)制這一大難題.