張 煒，萬(wàn)巧鳳，馬 銳，黃 菱，王 麗

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)系，銀川 750004）

枸杞為茄科灌木植物，其成熟果實(shí)——枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子的主要生物活性成分，是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成的一種大分子水溶性多糖。近年來(lái)廣泛的藥理學(xué)研究表明，LBP 具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和神經(jīng)保護(hù)[7-8]等作用。樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是目前所知抗原提呈能力最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），參與抗原的識(shí)別、加工處理與提呈，在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9]。DC2.4細(xì)胞是通過(guò)轉(zhuǎn)染癌基因v-myc和v-raf的C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞而建立的永生化細(xì)胞系[10]，具有很強(qiáng)的吞噬功能，是用于DC研究的一種標(biāo)準(zhǔn)的未成熟細(xì)胞系[11]。本研究以未成熟樹(shù)突狀DC2.4細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)觀察LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞增殖、抗原吞噬及成熟的影響，初步探討LBP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 DC2.4是將myc和raf癌基因轉(zhuǎn)染至C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞而建立的DC細(xì)胞株。DC2.4細(xì)胞（AY0006）購(gòu)自上海慧穎生物科技有限公司。

1.1.2 藥品 LBP（寧夏啟元藥業(yè)有限公司，純度＞90%），由寧夏醫(yī)科大學(xué)劉志宏老師課題組惠贈(zèng)，用含1‰ DMSO的 RPMI 1640不完全培養(yǎng)基配制成1 g·L-1的LBP母液，再用 0.22 μm 濾器（Millpore）過(guò)濾除菌后分裝，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?.1.3 試劑 CCK-8試劑盒（東仁化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：CK04）；脂多糖（LPS，Sigma，批號(hào)：L-2880）；胎牛血清（Gibco，貨號(hào)：26010074）、RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，貨號(hào)：31870082）；FITC 標(biāo)記的卵清蛋白（OVA）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0283P）、PE標(biāo)記兔抗鼠CD86抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-1035R）。

1.2 方法

1.2.1 DC2.4細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)DC2.4細(xì)胞，隔天換液。觀察細(xì)胞形態(tài)，傳代3～4次后，挑選狀態(tài)良好的細(xì)胞備用。

1.2.2 LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞增殖的影響 將DC2.4細(xì)胞接種于96孔板，5000個(gè)/孔。待細(xì)胞貼壁后換用含有5%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，同步化培養(yǎng)13～14 h后進(jìn)行不同處理?？瞻讓?duì)照組無(wú)任何處理；LBP組分別加入終濃度為200μg·mL-1、100 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的 LBP（對(duì)應(yīng)高、中、低濃度組）；LPS 組加入終濃度為 5 μg·mL-1的LPS。設(shè)置6個(gè)復(fù)孔/組，在37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng) 12 h、24 h、48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光值。

1.2.3 LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞吞噬OVA的影響 接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DC2.4細(xì)胞于12孔板，3×105個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同處理。空白對(duì)照組無(wú)任何處理；LBP 組分別加入終濃度為 200 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的 LBP，于 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入終濃度為50 μg·mL-1的 FITC-OVA 無(wú)血清培養(yǎng)基 2 mL。再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用4℃預(yù)冷的PBS液終止反應(yīng)，經(jīng)消化、離心后收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS洗滌2次，最后取500 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬熒光素的吞噬細(xì)胞百分比。

1.2.4 LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞成熟標(biāo)志分子CD86的影響 接種DC2.4細(xì)胞于12孔板，3×105個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同處理?？瞻讓?duì)照組無(wú)任何處理；LBP 組加入終濃度為 100 μg·mL-1的 LBP；LPS 組加入終濃度為 5 μg·mL-1的 LPS；LPS+LBP組加入終濃度為 5 μg·mL-1的 LPS 及 100 μg·mL-1的 LBP。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔/組，在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，消化、收集各組細(xì)胞。每孔分別加入終濃度為5 mg·L-1的PE標(biāo)記CD86抗體1 μL，37℃、避光孵育 30 min，然后用預(yù)冷 PBS洗3遍，最后取500 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理與分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC2.4細(xì)胞的觀察

倒置顯微鏡下觀察DC2.4細(xì)胞，為貼壁黏附生長(zhǎng)細(xì)胞，其形態(tài)與小鼠骨髓來(lái)源的DC形態(tài)特征相似，符合不成熟DC的特點(diǎn)[12]。細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。

2.2 LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h和48 h后，DC2.4細(xì)胞增殖（P＜0.05）。加入LPS后，在12 h、24 h及48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，DC2.4細(xì)胞均增殖（P＜0.05）。LBP 組高、中濃度組在 12 h、24 h及48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)能促進(jìn)DC2.4細(xì)胞增殖，增殖水平接近空白對(duì)照細(xì)胞；低濃度組在24h和48h均可促進(jìn)DC2.4細(xì)胞增殖（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞吞噬OVA的影響

抗原吞噬結(jié)果如圖3所示，高、中、低濃度LBP均可促進(jìn)DC2.4細(xì)胞吞噬抗原，吞噬細(xì)胞百分比分別為28.2%、30.2%和23.3%，均高于空白對(duì)照組（18.9%）（P均＜0.05）。

2.4 LBP對(duì)LPS誘導(dǎo)的DC2.4成熟標(biāo)志分子CD86的影響

檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，單獨(dú)使用LPS或LBP，均可上調(diào) CD86表達(dá)（P＜0.01）；聯(lián)合使用LPS和LBP后，CD86的表達(dá)低于LPS組（P＜0.05）。

3 討論

DC是機(jī)體中最重要的APC，它不僅能激活免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)免疫耐受，發(fā)揮著維持機(jī)體免疫平衡的重要作用。DC的功能與其所處的發(fā)育階段有著密切的關(guān)系——未成熟DC捕獲和加工抗原的能力比較強(qiáng)，但提呈抗原的能力非常弱；成熟DC抗原提呈的能力比較強(qiáng)，但捕獲和加工抗原的能力非常弱[11]。未成熟DC在攝取抗原或受到LPS等因素刺激后，呈遞抗原的能力逐漸增強(qiáng)，而攝取、加工處理抗原的能力逐漸減弱，最終發(fā)育為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞[13]。本實(shí)驗(yàn)所用DC2.4細(xì)胞是先用GM-CSF轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞，然后再轉(zhuǎn)染myc和raf癌基因而建立的永生化細(xì)胞株，其攝取抗原后可從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)[14]。OVA是抗原吞噬研究中常用的外源性抗原，與異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）偶聯(lián)后，可被未成熟 DC2.4細(xì)胞吞噬。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬熒光素的吞噬細(xì)胞百分率，可間接反映DC2.4細(xì)胞吞噬抗原的能力[15]。CD80和CD86是重要的共刺激分子，對(duì)T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的相互作用具有重要的影響[16]，在DC成熟過(guò)程中，CD86表達(dá)上調(diào)，使DC與T細(xì)胞接觸持久而穩(wěn)定[17]。

本研究結(jié)果顯示：在LBP對(duì)DC2.4細(xì)胞增殖影響實(shí)驗(yàn)中，100 μg·mL-1及 200 μg·mL-1LBP 在作用12 h、24 h、48 h后均不能促進(jìn)DC2.4增殖，而 20 μg·mL-1LBP 在 24 h、48 h 均可促進(jìn) DC2.4細(xì)胞增殖，說(shuō)明中、高濃度LBP具有維持細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)效應(yīng)。在LBP對(duì)DC2.4吞噬抗原影響實(shí)驗(yàn)中，20 μg·mL-1、100 μg·mL-1及 200 μg·mL-1LBP均可促進(jìn)DC2.4細(xì)胞吞噬抗原，以100 μg·mL-1LBP促抗原吞噬作用最佳。在LBP對(duì)DC2.4成熟影響實(shí)驗(yàn)中，LPS和LBP均可上調(diào)DC2.4細(xì)胞表面CD86的表達(dá)，但LPS和LBP聯(lián)合使用后，CD86的表達(dá)低于單用LPS，說(shuō)明LBP可適度抑制LPS誘導(dǎo)促進(jìn)DC2.4成熟作用。

綜上所述，LBP發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的生物學(xué)機(jī)制可能與影響DC的功能相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅僅初步探究了LBP對(duì)DC2.4部分功能的影響作用，下一步將深入探究其對(duì)LPS誘導(dǎo)DC2.4的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子的影響以及對(duì)共培養(yǎng)的初始T細(xì)胞的影響，以期進(jìn)一步確定LBP發(fā)揮抗炎效應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。