李夢瑤, 王書雅, 謝云峰, 劉云國, 翟 晨*

1. 中糧營養(yǎng)健康研究院營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209 2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830002 3. 臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000

引 言

過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、果膠酶(pectinases，PE)和羧酸酯酶 (carboxylesterase, CXE) 等蛋白酶類的活性的變化是評判果蔬等農(nóng)副產(chǎn)品劣變程度的一個(gè)重要指標(biāo)。CAT和SOD可以消除過氧化氫、活性氧等細(xì)胞代謝的有害物質(zhì)，PPO催化多酚物質(zhì)形成醌類化合物形成，具有提高植物光合作用、增強(qiáng)植物防御能力和延緩衰老等作用[1-2]。PE分解果膠質(zhì)，其主要與果蔬的后熟、果肉軟化、質(zhì)地、色澤及果汁的含量有關(guān)，有研究表明果膠酶與果蔬貯藏期間劣變程度呈負(fù)相關(guān)，其活性的高低可以間接反映農(nóng)副產(chǎn)品新鮮程度。CXE是一類廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中具有α/β折疊結(jié)構(gòu)域的水解酶類，能有效地催化酯類和酰胺類化合物水解，與多種藥物、環(huán)境毒物及致癌物的解毒和代謝有關(guān)，并參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝[3-4]。目前，對CAT，SOD，PPO，PE和CXE等相關(guān)蛋白酶類的檢測方法有很多，如色譜法、化學(xué)發(fā)光法、比色法、電化學(xué)分析法等[5-8]。通過實(shí)際應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力較難實(shí)現(xiàn)多酶同時(shí)檢測。

免疫熒光法和熒光探針法因其具有簡便性和較高的靈敏度等特點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用[9, 11]。Zhou等[9]報(bào)道了一種新型溶酶體靶向熒光探針，其發(fā)射波長為575 nm，用于檢測活細(xì)胞、血清和組織中羧酸酯酶；Jin等[10]制備了一種新的近紅外熒光探針，用于檢測活細(xì)胞和小鼠內(nèi)源性羧酸酯酶；免疫熒光分析技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于微生物、農(nóng)獸藥殘留、蛋白類毒素、重金屬殘留等方面的檢測[12-14]。目前，基于熒光光譜法，結(jié)合熒光免疫法和熒光探針法以實(shí)現(xiàn)多種酶活性同時(shí)檢測的研究較少。本研究基于熒光光譜的檢測原理，針對不同酶類的特性，合成了具有定向識(shí)別特異性的熒光探針，結(jié)合熒光免疫法和熒光探針法，開發(fā)了多酶同時(shí)檢測熒光傳感器陣列，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品中多種酶活性的一次性、可視化檢測。

實(shí)驗(yàn)根據(jù)以熒光光譜信號的變化，對不同類型的探針合成條件和檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化?；跓晒夤庾V法，結(jié)合免疫熒光法和熒光探針，建立了番茄蛋白酶類劣變因子熒光傳感器陣列檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對多個(gè)樣品中多種酶活性的同時(shí)快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

IR-783碘化物、間苯二酚、4-(氯甲基)苯基乙酸酯、CAT、SOD、PE、PPO、CXE購自Sigma-Aldrich公司；抗體購自Agrisera公司；量子點(diǎn)(CdSe/ZnS)購自上海昆道生物科技有限公司；黑色96孔酶標(biāo)板購自美國Corning公司。實(shí)驗(yàn)中使用的水為Milli-Q超純水，0.05% PBS-T(pH 7.4 PBS添加0.05% Tween-20), 其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；Synergy Mx熒光酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司。

1.3 熒光免疫分析法

1.3.1 果膠酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶熒光探針的合成

量取100 μL量子點(diǎn)至700 μL 25 mmol·L-1pH 6.0 PBS 緩沖液中，加入100 μL 3 mg·mL-1NHS和100 μL 2 mg·mL-1EDC溶液，超聲分散均勻，置于30 ℃ 250 r·min-1的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，于8 000 r·min-1的離心機(jī)中常溫離心10 min，去掉上清液。加入1 mL 500 U·mL-1果膠酶(800 U·mL-1過氧化氫酶、900 U·mL-1超氧化物歧化酶)溶液復(fù)溶，超聲分散均勻，置于37 ℃ 250 r·min-1恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1.5 h，離心10 min，去掉上清液。加入1 mL pH 7.4的PBS-T溶液，超聲分散均勻，在250 r·min-1，37 ℃搖床震蕩1 h，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹14]。

1.3.2 熒光免疫檢測方法的建立

用pH 7.4，PBS緩沖液對果膠酶(過氧化氫酶/超氧化物歧化酶)抗體進(jìn)行稀釋，100 μL·孔-1添加至酶標(biāo)板微孔中，置于4 ℃包被過夜；用0.05% PBS-T洗板三次除去多余的抗體；添加封閉液1% BSA 250 μL·孔-1，于37 ℃條件下封閉空白位點(diǎn)1.5 h，用0.05% PBS-T洗滌三次；每孔加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(或樣品溶液)和50 μL熒光探針溶液(PBS 稀釋)，在 37 ℃下持續(xù)反應(yīng)1 h。用PBS-T洗滌三次后每孔加入100 μL PBS緩沖液，用酶標(biāo)儀測定其熒光光譜信號，設(shè)定激發(fā)波長為375 nm，測定570 nm(524 nm/622 nm)處的熒光光譜信號，繪制不同活性的果膠酶(過氧化氫酶/超氧化物歧化酶)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)射光譜。

1.4 近紅外熒光探針法

1.4.1 羧酸酯酶和多酚氧化酶熒光探針的合成

羧酸酯酶熒光探針：將間苯二酚(110.0 mg，1 mmol)和碳酸鉀(138 mg，1 mmol)溶解于乙腈(20 mL)中，在室溫及氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌10 min，然后將溶解于乙腈(1 mL)中的IR-783碘代物 (374.5 mg，0.5 mmol)加入到體系中。將反應(yīng)混合物在50 ℃下反應(yīng)5 h，反應(yīng)完畢，減壓蒸除溶劑，得粗產(chǎn)品。用硅膠柱層析純化粗產(chǎn)品，以二氯甲烷/甲醇(20∶1，V/V)作洗脫劑，得到產(chǎn)物為藍(lán)綠色粉末。

將上述合成的藍(lán)綠色粉末(375 mg，0.5 mmol)和碳酸鉀(103.5 mg，0.75 mmol)溶解于乙腈(4 mL)中，在室溫及氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌10 min，然后將溶解于乙腈(1 mL)中的4-(氯甲基)苯基乙酸(180 mg，1.0 mmol)加入到混合溶液中，將反應(yīng)混合物在50 ℃反應(yīng)5 h。反應(yīng)完畢，真空干燥除溶劑，得粗產(chǎn)品。用硅膠柱層析提純粗產(chǎn)品，二氯甲烷/甲醇=10∶1，得到產(chǎn)物為深藍(lán)色固體，即為羧酸酯酶熒光探針。

多酚氧化酶熒光探針：合成步驟參考Zhang等[15]的研究。

1.4.2 近紅外熒光探針檢測方法的建立

首先，配置探針儲(chǔ)備液1 mmol·L-1，在離心管中稱取3.27 mg羧酸酯酶探針(3.06 mg多酚氧化酶探針)，加入5 mL二甲基亞砜(DMSO)。其次，在5 mL的具刻度管里，加入4 mL的PBS緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH 7.4)以及50 μL的探針的儲(chǔ)備溶液，混合均勻后加入不同濃度的羧酸酯酶(多酚氧化酶)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS將溶液定容至5 mL，混合均勻。在37 ℃下反應(yīng)30 min(3 h)后，將0.1 mL反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，在光譜儀上測量熒光強(qiáng)度F。設(shè)定激發(fā)波長為670 nm，測定705 nm(708 nm) 處的熒光強(qiáng)度，繪制不同活性的羧酸酯酶(多酚氧化酶)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)射光譜。

1.5 方法學(xué)評價(jià)與應(yīng)用

1.5.1 特異性實(shí)驗(yàn)

果蔬等樣品的粗提液基質(zhì)較為復(fù)雜，為了研究在最佳條件下其他物質(zhì)是否會(huì)干擾酶的檢測。本實(shí)驗(yàn)通過在相同條件下，對樣本中各種可能存在的干擾物質(zhì)，例如NaCl、KCl、CaCl2、抗壞血酸鈉、葡萄糖、氨基酸(絲氨酸，蘇氨酸)進(jìn)行了探究。

1.5.2 樣品預(yù)處理和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取新鮮的番茄，洗凈晾干，于攪拌機(jī)中打碎10 min，在冰浴狀態(tài)下用研缽研磨至泥狀。料液比按1: 2的比例稱取一定量的番茄泥，加入樣品提取液(0.05 mol·L-1PBS緩沖液)在4 ℃高速離心機(jī)中以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心30 min，取上清液作為樣本溶液。進(jìn)行超高溫加熱處理，致使樣本溶液中的酶失活，待其冷卻至室溫。添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)品于樣本溶液中，采用建立的方法對樣本溶液進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 原理

2.1.1 熒光免疫檢測方法原理

如圖1(a)所示，通過1.3.1制備量子點(diǎn)熒光探針。將抗體直接固定在酶標(biāo)板的微孔中，向微孔中同時(shí)加入熒光探針和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酶溶液。在此步驟中，標(biāo)準(zhǔn)溶液中的酶將與熒光探針競爭結(jié)合包被在酶標(biāo)板上的固相抗體，形成熒光免疫復(fù)合物，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的熒光免疫復(fù)合物的熒光光譜信號，因此可將此性質(zhì)用于果膠酶(過氧化氫酶、超氧化物歧化酶)的活性檢測；熒光光譜信號的變化與酶的活性呈反比，通過測定相關(guān)熒光光譜信號的變化可測定酶的活性。

圖1 (a)熒光免疫分析法檢測原理；(b)近紅外熒光探針合成及其與羧酸酯酶的反應(yīng)；(c)多酶同時(shí)檢測示意圖

2.1.2 近紅外熒光探針法原理

如圖1(b)所示，通過引入羧酸酯酶特異性識(shí)別基團(tuán)4-乙酰氧基芐，合成了熒光探針即化合物1，其本身的熒光強(qiáng)度較低，羧酸酯酶可導(dǎo)致化合物1中的高水溶性苯基乙酸酯水解、電子發(fā)生重排，最終重新釋放具有強(qiáng)熒光團(tuán)的化合物2，該化合物在706 nm處具有較強(qiáng)熒光信號，因此可將此性質(zhì)用于羧酸酯酶檢測；熒光光譜信號的變化與羧酸酯酶的活性呈正比，通過測定相關(guān)熒光信號的變化可測定羧酸酯酶的活性。基于此原理，通過引入多酚氧化酶特異性識(shí)別基團(tuán)3-羥基芐氧基，合成了特異強(qiáng)、檢測限低的多酚氧化酶的識(shí)別近紅外熒光探針。

2.1.3 同時(shí)檢測原理

本研究基于熒光光譜陣列分析法的檢測原理，針對番茄中特征劣變蛋白酶的特性，合成了具有定向特異性的熒光探針，結(jié)合熒光免疫法和熒光探針法，開發(fā)了多酶同時(shí)檢測的熒光傳感器陣列，利用熒光酶標(biāo)儀可針對不通熒光物質(zhì)設(shè)置相應(yīng)的激發(fā)波長和發(fā)射波長特點(diǎn)，以及可以同時(shí)獨(dú)立的檢測多個(gè)樣品的特性，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品中多種酶活性的同時(shí)快速可視化檢測[圖1(c)]。

2.2 免疫熒光檢測方法的建立

以果膠酶檢測模型建立為例，在最佳反應(yīng)條件下(pH 7.4 PBS中37 ℃反應(yīng)60 min)，考察了探針對不同濃度的果膠酶(0，0.05，1，50，100，200，300，400和 500 U·mL-1)的熒光光譜信號的變化。由圖2(a)可知，果膠酶的活性在0.05～500 U·mL-1范圍內(nèi)，探針的熒光光譜信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程ΔF=1.696 4c(U·mL-1)+351.57 (R2=0.989 4)，其中ΔF是探針在有無果膠酶存在的條件下其熒光光譜信號的變化，其最低檢測限為5.0×10-3U·mL-1。

基于相同原理和方法，建立過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性檢測模型，其中，過氧化氫酶的線性范圍為0.02～800 U·mL-1，相關(guān)系數(shù)為0.993 8，檢測限2.0×10-3U·mL-1；超氧化物歧化酶的線性范圍為0.5～900 U·mL-1，相關(guān)系數(shù)為0.981 9，檢測限5.0×10-2U·mL-1。

2.3 羧酸酯酶熒光探針檢測方法的建立

在最佳反應(yīng)條件下(pH 7.4 PBS中37 ℃反應(yīng)30 min)，考察了探針對不同濃度的羧酸酯酶(0，0.01，0.025，0.05，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.6和1 U·mL-1)的熒光光譜信號的變化。由圖2(b)可知，羧酸酯酶的活性在0.01～0.3 U·mL-1范圍內(nèi)，探針的熒光光譜信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程ΔF=1 985.9c(U·mL-1)+160.7 (R2=0.991 0)，其中ΔF是探針在有無羧酸酯酶存在的條件下其熒光信號的變化。其最低檢測限為3.4×10-3U·mL-1?；谙嗤砗头椒?，建立了多酚氧化酶的活性檢測模型，線性范圍為10～70 U·mL-1，相關(guān)系數(shù)為0.997 2，檢測限1.1×10-2U·mL-1。

圖2 (a)果膠酶的熒光光譜圖和線性關(guān)系圖；(b)探針(10 μmol·L-1)與羧酸酯酶反應(yīng)的熒光光譜和線性關(guān)系圖

2.4 特異性試驗(yàn)

以果膠酶熒光探針的特異性試驗(yàn)為例。本實(shí)驗(yàn)空白對照孔(50 μL PBS)熒光強(qiáng)度F0，含有不同種類干擾物質(zhì)(30 μmol·L-1的KCl、CaCl2、NaCl、15 mmol·L-1的抗壞血酸鈉、葡萄糖、絲氨酸、蘇氨酸)和100 U·mL-1果膠酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的熒光強(qiáng)度F，以相對熒光強(qiáng)度ΔF(ΔF=F0-F)考察不同抗原對免疫檢測熒光信號的影響。如圖3所示，和其他干擾物的熒光信號值相比，含有果膠酶的熒光響應(yīng)信號值較高，這表明該探針對果膠酶具有較好的選擇性，且在復(fù)雜的樣本生物環(huán)境中具有很高的特異性?；谙嗤姆椒ㄔ恚瑢ζ渌?種酶的熒光探針的特異性進(jìn)行了研究，均表現(xiàn)出較好的選擇性。

圖3 免疫熒光探針與其他干擾物的熒光響應(yīng)信號Fig.3 Fluorescence responses of immune-fluorescent probes with other interferences

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)按照1.5.2步驟制備番茄樣品提取液，并對五種酶進(jìn)行三個(gè)梯度的加標(biāo)回收，分別對每種酶進(jìn)行五組平行試驗(yàn)，基于所開發(fā)的方法，對72個(gè)樣品進(jìn)行同時(shí)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，應(yīng)用該方法檢測得到的回收率在90.0%～102.3%之間，變異系數(shù)<15%，說明所建立方法準(zhǔn)確度好，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。

表1 番茄樣品添加回收實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 1 Addition and recycling experiment of sample (n=5)

3 結(jié) 論

基于熒光光譜法，結(jié)合免疫熒光法和熒光探針，建立了番茄蛋白酶類劣變因子熒光傳感器陣列檢測技術(shù)。實(shí)驗(yàn)以熒光信號的變化為指標(biāo)，對熒光探針合成條件、檢測時(shí)間及免疫熒光分析檢測條件等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，分別建立果膠酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、羧酸酯酶和多酚氧化酶5種酶的檢測模型，其相關(guān)系數(shù)分別為0.989 4，0.993 8，0.981 9，0.991 0和0.997 2，最低檢測限分別為5.0×10-3，2.0×10-3，5.0×10-2，3.4×10-3和1.1×10-2U·mL-1?；诙喙δ軣晒饷笜?biāo)儀可針對不同熒光物質(zhì)設(shè)置相應(yīng)的激發(fā)波長和發(fā)射波長，通過一次掃描檢測實(shí)現(xiàn)5種酶的同時(shí)可視化陣列檢測技術(shù)，并對番茄樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法回收率高，且具有較好的穩(wěn)定性和特異性。所建立的方法可以實(shí)現(xiàn)樣品中多種酶的同時(shí)、快速檢測，為實(shí)際檢測節(jié)省了大量時(shí)間，具有良好的應(yīng)用前景。