陳小雷 胡 王 馬朝彬 凌 俊 段國慶 鮑 凱

(1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所 水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室 合肥 230031；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學院 合肥 230031；3. 阜陽市老廟鎮(zhèn)農(nóng)村綜合服務站 阜陽 236143；4. 安徽惠民實業(yè)有限責任公司 蕪湖 238331)

蟹黃鮮蝦醬是將巢湖秀麗白蝦(Exopalaemon modestus)、河蟹(Eriocheir sinensis)蟹黃煸炒后添加到黃豆醬中，經(jīng)炒制、調(diào)味、冷卻、包裝、高溫殺菌后制成的佐餐調(diào)味醬。蟹黃鮮蝦醬油脂含量高，富含高蛋白、高不飽和脂肪酸蟹黃、鮮蝦的添加使其在貯藏過程中更易出現(xiàn)脂肪酸敗和蛋白質(zhì)氧化變質(zhì)，進而影響蟹黃鮮蝦醬的組織、風味等特性，且氧化產(chǎn)物會引起人體動脈粥樣硬化、胃腸病以及癌癥等(Negre-Salvayre et al, 2010)。

丁香既是GB2760-2014 中允許使用的食用香料，又是植物源食品保鮮劑和抗氧化劑，除賦予食品獨特的風味外(Suhaj, 2006)，還能降低食品的過氧化物值(沈勇根等, 2012)，抑制漢母遜氏酵母菌(Torujopsis)、青霉(Penicillium)、黑曲霉(Rhizopus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(Escherichia coli)的生長(吳傳茂等, 2000)，丁香油和桂皮油復合使用能延緩冷卻豬肉的腐敗變質(zhì)(姚成強等, 2011)，丁香醇提取物可以延長新鮮羊肉保質(zhì)期至4 d (Kumudavally et al, 2011)。在實際使用過程中，丁香油少量添加達不到抗氧化效果，大量使用則會影響產(chǎn)品的風味?；诖?，本研究著重考察丁香油作為香料和抗氧化劑對蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中風味、脂肪酸組成及含量、蛋白質(zhì)和脂肪氧化的影響，以探索蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中，脂肪氧化與脂肪酸組成及含量的關(guān)系，并為丁香油在醬制品的工業(yè)化應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蟹黃鮮蝦醬采自安徽省惠民實業(yè)有限責任公司，采購時間為2018 年6 月；丁香油為丁香全提取物，總酚含量約80%，購自陜西浩洋生物科技有限公司，采購時間為2018 年6 月。

高氯酸、尿素、十二烷基磺酸鈉、乙二胺四乙酸、Tris-HCl 等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；IMP(5′-肌苷酸)標準品、GMP(5′-鳥苷酸)標準品、AMP(5′-腺苷酸)標準品，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；MDA 試劑盒和BCA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗儀器

FA25 型高速分散機，弗魯克(上海)公司；CR22G型高速冷凍離心機，日本日立公司；TU-1901 紫外–可見分光光度計，北京普析通用儀器公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；GC-2010 Plus氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理 按照安徽省惠民實業(yè)有限公司生產(chǎn)蟹黃鮮蝦醬常規(guī)方法制好后，平均分成2 組：1 組按醬質(zhì)量添加0.2%丁香油，混勻，分裝后121℃高溫滅菌30 min，為實驗組；另1 組分裝后121℃高溫滅菌30 min，為對照組。2 組樣品于25℃恒溫貯藏，每45 d 取樣進行檢測，每組6 個平行。

1.3.2 游離氨基酸的測定 參考Wang 等(2016)的方法并稍作修改。將醬制品混勻，取適量均質(zhì)后加入15 ml 5%三氯乙酸溶液，冰浴勻漿2 min，超聲5 min后靜置2 h，4℃ 15000 r/min 離心10 min。取5 ml上清液，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至(2.00±0.05)后，蒸餾水定容至10 ml。取適量溶液過0.45 μm 的水相針式超濾膜后待檢測。將待測液放入自動氨基酸分析儀中，在570 和440 nm (Pro)下進行檢測。

1.3.3 脂肪酸的測定 按照GB 5009.168-2016 方法測定。

1.3.4 呈味核苷酸的測定 參照Kong 等(2012)的方法并稍作修改。稱(5.00±0.01) g 樣品均質(zhì)后加入30 ml 4℃預冷的5% HClO4溶液，冰浴勻漿2 min 后超聲5 min，然后4℃ 15000 r/min 冷凍，離心10 min取上清液，向沉淀加入10 ml 4℃預冷的5% HClO4溶液，重復上述步驟至離心結(jié)束，合并2 次上清液，用提前配好的KOH 和HClO4溶液調(diào)節(jié)pH 至5.75，之后將上清液定容至50 ml，取適量用0.22 μm 微量過濾膜過濾至進樣瓶，待測。

高效液相色譜條件如下：色譜柱：島津Intersil ODS-3(205.0 mm×4.6 mm)；柱溫為30℃；流動相：甲醇(A)和 pH 為 5.75 的磷酸緩沖液(B)；流速：1 ml/min；洗脫程序見表1，洗脫時間為30 min；PDA檢測器全波段掃描，選取248 nm 進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.5 味道強度值(TAV)及味精當量(EUC) 參照王丹青等(2018)，滋味物質(zhì)的味道強度值(Taste activity value)的計算公式如下：

式中，C 為滋味物質(zhì)的絕對濃度值，T 為該滋味物質(zhì)的閾值。

味道當量(Equivalent umami concentration)的計算公式如下：

式中，EUC 單位為g MSG/100 g；1218 為協(xié)同作用常數(shù)；ai 為鮮味氨基酸的濃度(g/100 g)；bi 為鮮味氨基酸相對于MSG 的鮮度系數(shù)(天門冬氨酸Asp為0.077, 谷氨酸Glu 為1)；aj 為呈味氨基酸的濃度(g/100 g)；bj 為呈味氨基酸相對于IMP 的鮮度系數(shù)(IMP 為1, GMP 為2.3, AMP 為0.18)。

1.3.6 總巰基含量的測定 (1)肌原纖維蛋白的提取：參照Yang 等(2015)的方法。取10 g 樣品，加入20 ml、4℃預冷的去離子水，12000 r/min 勻漿30 s，10000 r/min、4℃離心20 min，棄上清液，向沉淀加入去離子水，重復提取1 次。沉淀中再加入20 ml、4℃預冷的0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 為7.2)(其中補充0.6 mol/L NaCl)，12000 r/min 勻漿30 s，10000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液。沉淀用上述含有NaCl的磷酸緩沖液重復提取1 次，合并上清液。蛋白質(zhì)含量采用BCA 試劑盒測定。

(2)總巰基含量的測定：參考Benjakul 等(2009)的方法。調(diào)節(jié)(1)中提取的肌原纖維蛋白溶液濃度至4 mg/ml，取0.5 ml，加入4.5 ml 0.2 mol/L Tris-HCl Buffer [pH 為6.8，含有8 mol/L 尿素、2%十二烷基磺酸鈉(SDS)、10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)]。取1 ml 上述混合液，加入0.1 ml 0.1% DTNB，40℃溫育25 min，測定其OD412nm?？瞻讓φ找?.6 mol/L KCl溶液(pH 為7.0)代替樣品?？値€基含量的計算公式如下：

總巰基含量(nmol/mg) = [(D×n)/(ε ρ)]×106(3)

式中，D 為412 nm 波長處的吸光度；n 為稀釋倍數(shù)；ε 為摩爾吸光系數(shù)，取值為13600 L/(mol·cm)；ρ 為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)。1.3.7 丙二醛含量的測定 稱取定量蟹黃鮮蝦醬，加入5 倍體積去離子水，10000 r/min 勻漿1 min，進行丙二醛含量的檢測。依據(jù)硫代巴比妥酸法原理采用試劑盒檢測，結(jié)果以 1 mg 樣品中丙二醛的含量(nmol/mg)表示。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果采用平均值±標準差(Mean±SD, n=6)表示。采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和多重方差分析，所有顯著性均在P≤0.05水平下檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中丙二醛含量的變化

丙二醛常用來衡量脂質(zhì)氧化程度，其含量越高，肉制品氧化程度就越高，品質(zhì)也越差(Pignoli et al,2009)。作為脂肪氧化二級產(chǎn)物，丙二醛還可以與蛋白的多肽骨架及其邊鏈發(fā)生氧化修飾，改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象(Zhao et al, 2012)。

蟹黃鮮蝦醬在25℃貯藏過程中丙二醛的變化情況見圖1。從圖1 可以看出，對照組和實驗組丙二醛含量均顯著升高。0 d 時，對照組和實驗組差異不顯著；45 d 后，對照組顯著高于實驗組，說明0.2%的丁香油對蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中脂肪氧化有抑制作用，這與江慎華等(2010)、沈勇根等(2012)、Karuppiah 等(2012)的研究結(jié)果一致，因為丁香油的主要物質(zhì)丁香酚(沈勇根等, 2012)具有疏水性，疏水性氨基酸可以捕獲脂類自由基，加強抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸的相互作用，從而延緩脂質(zhì)氧化反應(Burt, 2004)。

圖1 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程丙二醛含量變化Fig.1 The changes of MDA content during storage of crab cream and shrimp sauce

2.2 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中總巰基含量的變化

肉品中蛋白質(zhì)的巰基含量很豐富，且易發(fā)生氧化反應(陸玉芹等, 2015)，在加工、運輸、貯藏過程中，肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使埋藏在分子內(nèi)部的疏基活性基團暴露出來被氧化成二硫鍵，導致疏基含量減少(Dean et al, 1997)，因而常用巰基含量的變化指示蛋白質(zhì)氧化的程度(屠冰心等, 2014)。蛋白質(zhì)氧化會降低肉制品品質(zhì)、功能及消費者的可接受性。

蟹黃鮮蝦醬在25℃貯藏過程中總巰基含量的變化如圖2 所示。隨著貯藏時間的延長，對照組和實驗組總巰基含量呈下降趨勢，貯藏90 d 以上，總巰基含量均顯著降低，因為經(jīng)過加熱和高溫滅菌處理，蟹黃鮮蝦醬中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且受到各種促氧化成分如自由基等的攻擊，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，巰基含量下降(Xia et al, 2009)。貯藏90 d 后，實驗組總巰基含量顯著高于對照組，說明丁香油對蟹黃鮮蝦醬貯藏過程蛋白質(zhì)氧化有抑制作用，與Karuppiah 等(2012)和姚潔玉等(2019)的研究結(jié)果類似，因為脂質(zhì)氧化生成的活性和非活性自由基奪取蛋白的氫原子，生成蛋白自由基，引發(fā)蛋白質(zhì)鏈式反應，從而促進蛋白質(zhì)氧化(Stadtman et al, 2003)，而丁香油抑制脂肪氧化，也會對蛋白質(zhì)氧化起到一定的抑制作用。

圖2 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程總巰基含量的變化Fig.2 The changes of T-SH content during storage of crab cream and shrimp sauce

2.3 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中脂肪酸組成及含量的變化

肉類的營養(yǎng)和品質(zhì)與肌肉脂肪的含量和組成密切相關(guān)(Utaiwan et al, 2007)。脂肪酸的分解不僅導致食品風味的劣變，氧化產(chǎn)物還會與蛋白質(zhì)發(fā)生反應，進一步促進蛋白質(zhì)的氧化(Stadtman et al, 2003)。

對照組蟹黃鮮蝦醬在25℃貯藏過程中，脂肪酸組成及含量變化如表2 所示。新鮮蟹黃鮮蝦醬中共檢出 29 種脂肪酸，隨著貯藏時間的延長，脂肪酸種類不斷減少，180 d 后，僅檢出19 種。飽和脂肪酸總量從55.869%增至80.439%，單不飽和脂肪酸總量從19.141%降至 4.906%，多不飽和脂肪酸總量從24.991%降至14.655%；其中，C8 :0、C12 :0、C13 :0、C14 :1、C15 :0、C15:1、C16 :0、C17 :1、C18 :1n9t、C18 :2n6t、C20:1、C20 :3n6、C20:3n3、C20:4n6 和C22 :1n9 顯著降低，C16 :1、C17 :0、C18 :0、C18:2n6c、C20 :0、C18:3n3、C21 :0、C20 :2、C22 :0、C23 :0、C22:2n6和C20 :5n3 顯著升高。這種變化是因為蟹黃鮮蝦醬經(jīng)過加熱和高溫滅菌處理，加之貯藏過程中溫度、自由基等因素的影響，脂肪酸體系受到破壞，不飽和脂肪酸優(yōu)先發(fā)生氧化降解(Yagiz et al, 2009)；同時，脂肪氧化過程中，自由基連鎖攻擊不飽和脂肪酸，使其趨于飽和，一部分不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變成飽和脂肪酸，一部分變成單不飽和脂肪酸(劉冬敏等, 2013)；一些長鏈不飽和脂肪酸多位于磷脂中，會發(fā)生碳鏈延長和去飽和現(xiàn)象(Memon et al, 2011)。

表1 高效液相法核苷酸梯度洗脫程序Tab.1 HPLC gradient elution program for nucleotide analysis

表2 對照組蟹黃鮮蝦醬貯藏過程脂肪酸組成及含量變化(g/100 g)Tab.2 The changes of fatty acids and their contents during storage of control crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

實驗組蟹黃鮮蝦醬25℃貯藏過程中，脂肪酸組成及含量變化如表3 所示。隨著貯藏時間的延長，飽和脂肪酸含量由55.786%升至69.814%，單不飽和脂肪酸由18.847%降至10.233%，多不飽和脂肪酸由25.367%降至19.953%；其中，C8 :0、C12 :0、C13 :0、C14 :0、C14 :1、C15 :0、C15 :1、C16 :0、C17:1、C18 :1n9t、C18 :1n9c、C18 :2n6t、C20 :1、C20:3n6、C20 :3n3、C20 :4n6 和C22:1n9 顯著降低，C16 :1、C17:0、C18 :0、C18 :2n6c、C20 :0、C18:3n3、C21 :0、C20 :2、C22 :0、C23 :0、C22 :2n6 和C20 :5n3 顯著升高，而C13 :0、C14 :0、C14:1、C15 :0、C15 :1、C16:0、C17 :0、C17 :1、C18 :1n9t、C20:1、C20 :3n6、C20:3n3、C20 :4n6 和C22:1n9 的變化趨勢與對照組有所不同。貯藏180 d后，實驗組飽和脂肪酸含量比對照組降低13.2%，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量分別提高1.1 倍和36.2%。由此可見，丁香油對蟹黃鮮蝦醬不飽和脂肪酸具有保護作用，因為丁香油的主要成分丁香酚能夠清除頑固2,2-二苯基-1-苦基肼自由基，降低過渡金屬離子的濃度，從而有效延緩不飽和脂肪酸反應生成烷氧基、過氧化氫的反應和脂質(zhì)過氧化啟動物鐵氧系螯合物的產(chǎn)生(羅雨婷等, 2017)。

表3 實驗組蟹黃鮮蝦醬貯藏過程脂肪酸組成及含量變化(g/100 g)Tab.3 The changes of fatty acids and their contents during storage of test crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

2.4 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中呈味核苷酸及游離氨基酸組成的變化

核苷酸是一種重要的呈味物質(zhì)，GMP 和IMP 鮮味最強，除了增鮮，核苷酸對甜味有增效作用，對咸味、苦味、酸味和焦味等有消殺作用(Fuke et al,1996)：IMP 增強食物的咸感，具有減鹽作用；GMP增強食物的入口爽滑感，能改善食物在口中滯留的感覺；AMP 在較低濃度(<50～100 mg/100 g)下呈甜味，當濃度>100 mg/100 g 時，甜味逐漸減弱，鮮味逐漸增強(Rotzoll et al, 2006)；低濃度的IMP 能夠增強AMP 的鮮味和甜味。對照組蟹黃鮮蝦醬在25℃貯藏過程中呈味氨基酸含量變化如表4 所示，含量最高的是GMP，其次是IMP。隨著貯藏時間的延長，3 種呈味核苷酸波動降低，因為在有水體系中，呈味核苷酸的穩(wěn)定性隨蟹黃鮮蝦醬pH、含水量、溫度和酸堿度的變化而變化(崔桂友, 1999)。

表4 對照組蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中呈味核苷酸及游離氨基酸組成的變化(g/100 g)Tab.4 The changes of taste nucleotides and free amino acids during storage of control crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

游離氨基酸的種類和含量與蟹黃鮮蝦醬的口感、風味、營養(yǎng)和生理活性有關(guān)(Namanug et al, 2010)。對照組蟹黃鮮蝦醬在25℃貯藏過程中游離氨基酸含量變化如表4 所示。檢出的16 種游離氨基酸貯藏180 d均顯著提高，因為隨著蟹黃鮮蝦醬貯藏時間的延長，蛋白質(zhì)不斷發(fā)生降解，導致游離氨基酸含量增加。呈鮮味氨基酸中，含量最高的為谷氨酸，與IMP 有顯著的協(xié)同增效作用，是蟹黃鮮蝦醬鮮味的主要貢獻者；呈甜味氨基酸中，丙氨酸含量最高，與谷氨酸、肌苷酸等呈味物質(zhì)有協(xié)同作用，還具有協(xié)助葡萄糖代謝的功能(趙亭亭等, 2018)，是蟹黃鮮蝦醬甜味的主要貢獻者；精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸雖然是苦味氨基酸，但對蟹黃鮮蝦醬特殊的水產(chǎn)風味具有重要的貢獻(Wang et al, 2015)。

實驗組蟹黃鮮蝦醬在25℃貯藏過程中呈味核苷酸及游離氨基酸的變化如表5 所示。GMP 和IMP 呈降低趨勢，180 d 后，分別降至0.306 和0.156 g/100 g；AMP 含量先降后升，180 d 后，升至0.180 g/100 g；呈味核苷酸總量先降后升，180 d 與0 d 差異不顯著。檢出的16 種游離氨基酸，主要為谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、絲氨酸和脯氨酸，占總游離氨基酸的78.13%。貯藏180 d后，16 種游離氨基酸含量均顯著提高；游離氨基酸總量，鮮味和甜味氨基酸含量貯藏45 d 后顯著升高。對照組蟹黃鮮蝦醬貯藏180 d 后，GMP、IMP 和AMP降低幅度分別為10.7%、29.4%和26.7%，實驗組GMP和IMP 降低幅度分別為8.8%和23.8%，而AMP 含量增加1.3 倍。GMP 是香菇和酵母的主要呈味物質(zhì)，具有菌類特征風味(孫芝楊, 2011)，IMP 和AMP 是蝦鮮味的特征呈味物質(zhì)(李婉君, 2015)，且AMP 的甜滋味輪廓表現(xiàn)出來是獨立的，使蟹黃鮮蝦醬變得香甜可口。說明丁香油能有效抑制蟹黃鮮蝦醬中主要呈蝦蟹風味核苷酸的分解，從而對蟹黃鮮蝦醬的主要風味起穩(wěn)定和強化作用，與Milan(2006)的結(jié)論一致。從游離氨基酸方面來看，蟹黃鮮蝦醬主要呈味物質(zhì)是谷氨酸，丁香油對其貯藏過程中的變化沒有顯著影響。蟹黃鮮蝦醬貯藏180 d 后，除了丙氨酸和賴氨酸，其余游離氨基酸含量在添加丁香油醬制品中均比不添加高，其中，對絲氨酸和蛋氨酸影響最大。蛋氨酸是醬制品揮發(fā)性風味物質(zhì)中含硫化合物的前體物 (趙改名等, 2006)，對醬制品風味有影響(康旭等, 2011)。丁香油對蟹黃鮮蝦醬的游離氨基酸的影響可能是通過抑制蛋白質(zhì)的氧化，促進其向游離氨基酸方向的降解實現(xiàn)的。

表5 實驗組蟹黃鮮蝦醬貯藏過程呈味核苷酸及游離氨基酸組成的變化(g/100 g)Tab.5 The changes of taste nucleotides and free amino acids during storage of test crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

2.5 蟹黃鮮蝦醬貯藏過程滋味強度值(TAV)及味精當量(EUC)的變化

TAV 是評價食品中單一組分的滋味強度及對整體風味貢獻最經(jīng)典和客觀的方法(王曜等, 2014)，TAV 值越大，說明該物質(zhì)對食品滋味貢獻越大。對照組和實驗組蟹黃鮮蝦醬貯藏過程呈味物質(zhì)的滋味強度值變化如表6～表7 所示。GMP、IMP 和谷氨酸是蟹黃鮮蝦醬中最主要的呈鮮味物質(zhì)。

表6 對照組蟹黃鮮蝦醬呈味物質(zhì)的閾值和貯藏過程滋味強度值、味精當量的變化(g/100 g)Tab.6 The changes of TAV and EUC during storage of control crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

表7 實驗組蟹黃鮮蝦醬呈味物質(zhì)的閾值和貯藏過程滋味強度值、味精當量的變化(g/100 g)Tab.7 The changes of TAV and EUC during storage of test crab cream and shrimp sauce (g/100 g)

EUC 可衡量鮮味氨基酸與呈味核苷酸混合產(chǎn)生的協(xié)同效應。對照組和實驗組蟹黃鮮蝦醬貯藏過程味精當量的變化如表6～表7 所示。隨著貯藏時間的延長，對照組和實驗組EUC 呈先下降后上升的趨勢，貯藏180 d 時，分別達到304.50 g 和389.58 g MSG/100 g，說明添加丁香油，對蟹黃鮮蝦醬的鮮甜味有提升作用。

3 結(jié)論

丁香油在蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中，能抑制丙二醛生成、總巰基降低和不飽和脂肪酸的分解，對蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中呈味核苷酸總量、鮮味氨基酸、甜味氨基酸和游離氨基酸總量也有顯著提高的作用，使醬制品的味精當量顯著高于不添加丁香油的醬制品。說明丁香油在蟹黃鮮蝦醬貯藏過程中，不僅具有抗脂肪和蛋白質(zhì)氧化的作用，還能提高蟹黃鮮蝦醬的貯藏穩(wěn)定性和風味。