孫鵬達(dá) 孫冬 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130041)

結(jié)直腸癌是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率位居第3位和第4位〔1〕，尤其年輕結(jié)直腸癌患者逐年增多，40%～50%的患者初診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此急需研究能夠有效控制結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的新型藥物和新的治療方案。研究表明桂枝提取物桂皮醛為桂枝的主要活性物質(zhì)，其含量占藥材的1%〔2〕，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗細(xì)菌等廣泛的生物學(xué)活性，故本研究通過體外培養(yǎng)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，應(yīng)用桂枝水提物對其進(jìn)行干預(yù)，探討其對SW480細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞藥物及試劑 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株由吉林省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所饋贈，桂枝水提物成分分析由長春中醫(yī)中藥研究院完成，稱取中藥桂枝1 000 g，將其研磨成粉狀，用適量的蒸餾水煎煮，持續(xù)30 min，過濾，去除沉渣。收集濾液，重復(fù)3次，獲取濾液經(jīng)5 000 r/min，離心30 min，棄去沉淀物，留取上清液，置凍干機(jī)內(nèi)凍干，收集凍干粉存放于干燥處，進(jìn)一步分離純化。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所。桂皮水提物指紋圖譜，其主要成分為：桂皮醛、肉桂酸、桂皮酸酯及香豆素等，見圖1。

圖1 中藥桂枝的HPLC指紋圖譜分析

1.2MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的sw480細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為4×104/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合狀態(tài)，共分4組，對照組只含有細(xì)胞和等體積培養(yǎng)液，低、中、高劑量組分別加入100、200、400 mg/ml桂枝水提物，持續(xù)觀察48 h后于培養(yǎng)結(jié)束前6 h每孔內(nèi)分別加入20 μl/ml(5 mg/L)MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清，每孔內(nèi)加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，置搖床上低速震蕩10 min，促使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞抑制率=(1-加藥組細(xì)胞A值÷對照組細(xì)胞A值)×100%

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去上清液分別加入0.25%胰蛋白酶消化液1 ml，消化2～3 min后，棄去消化液，加入3 ml培養(yǎng)液，分散細(xì)胞，離心棄上清，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，70%乙醇固定，置4℃冰箱內(nèi)保存，供流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期進(jìn)程。

1.4透射電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.3，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收取不同濃度的桂枝水提物作用后的SW480細(xì)胞懸液于錐形離心管內(nèi)，離心沉淀1 000 r/min，離心10 min，離心去上清，細(xì)胞沉淀物經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1桂枝水提物對SW480細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，各劑量桂枝水提物均可顯著降低細(xì)胞增殖的吸光度A值，各劑量桂枝水提物對SW480細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 不同濃度桂枝水提物對SW480細(xì)胞增殖的影響

2.2桂枝水提物對SW480細(xì)胞周期的影響 桂枝水提物對SW480細(xì)胞周期進(jìn)程均有抑制作用，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，且細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 不同濃度桂枝水提物對SW480細(xì)胞周期及凋亡率的影響

2.3透射電子顯微鏡結(jié)果 不同濃度桂枝水提物作用于SW480細(xì)胞后，可見細(xì)胞內(nèi)有大量空泡存在，線粒體腫脹，細(xì)胞核染色質(zhì)趨邊凝等，可見凋亡率，見圖2。

圖2 透射電鏡觀察SW480超微結(jié)構(gòu)

3 討 論

近年來，從天然植物中獲取抗腫瘤藥物的研究備受關(guān)注，并成為研究熱點(diǎn)〔4〕。桂枝作為傳統(tǒng)中藥可用來治療許多疾病，如：風(fēng)濕、發(fā)熱、月經(jīng)失調(diào)等，體外研究桂枝水提物對多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用機(jī)制，結(jié)果表明，桂枝水提物桂皮醛對人胃癌細(xì)胞BCG823細(xì)胞，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-4355細(xì)胞，人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞株和人肺癌細(xì)胞株A549，均有誘導(dǎo)凋亡及抑制細(xì)胞增殖作用〔5〕。因此，本研究應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度桂枝水提取物，對SW480細(xì)胞的增殖抑制作用獲得較為滿意的結(jié)果。MTT試劑可被哺乳動物活細(xì)胞線粒體中脫氫酶吸收，并將MTT試劑還原成藍(lán)色的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系〔6〕，故MTT實(shí)驗(yàn)可客觀反映抗腫瘤藥物對細(xì)胞增殖抑制效果，因此該實(shí)驗(yàn)被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究，具有一定的客觀性。此外，線粒體作為半自主細(xì)胞器，在細(xì)胞能量代謝和氧自由基生成過程中扮重要角色，極易受外界因素?fù)p傷，導(dǎo)致線粒體功能改變，細(xì)胞增殖受抑。

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示不同濃度的桂枝水提物對SW480細(xì)胞增殖周期各時相均有不同程度的抑制作用，細(xì)胞周期高度保守，受各種細(xì)胞因子嚴(yán)格控制〔7〕，任何一個環(huán)節(jié)失控即可發(fā)生功能和形態(tài)學(xué)改變。本研究結(jié)果表明SW480細(xì)胞對桂枝水提物具有一定濃度依賴性，均表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，從而使G2/M期細(xì)胞相對增多，G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞受損傷的普遍反映，這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上得到了體現(xiàn)。本研究中細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示SW480細(xì)胞經(jīng)桂枝水提物作用后，促使SW480細(xì)胞DNA合成下降，有絲分裂減少，凋亡比例增加，這一結(jié)果與Ka等〔8〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示桂枝水提物對SW480細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用。有可能成為人類結(jié)直腸癌治療的有效藥物。

此外，本研究還應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察經(jīng)不同濃度桂枝水提物作用后SW480細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，可見線粒體腫脹，有氣泡形成，細(xì)胞核染色質(zhì)濃染，趨邊，凝集，紡錘體斷裂，可見凋亡小體改變。文獻(xiàn)報(bào)道〔9〕，桂枝提物屬于細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于細(xì)胞周期的G1期，并通過與微管蛋白的作用，導(dǎo)致微管解聚，破壞細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使細(xì)胞有絲分裂停止于G1期，促使細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。因此，在分子生物學(xué)水平檢測桂枝的生物活性。進(jìn)一步闡明桂枝提物抗腫瘤機(jī)制。

綜上所述，桂枝水提物對SW480細(xì)胞增殖抑制作用具有一定濃度依賴性，尤其對細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果明顯，為了提高桂枝水提物的抗癌效果，同時減輕藥物的不良反應(yīng)，探索新的藥物劑型，在降低毒副作用的基礎(chǔ)上通過增加劑量，以及延長作用時間對桂枝水提物進(jìn)行修飾改造，以期達(dá)到對人類結(jié)直腸癌治療開辟新的治療途徑。