陳光富，徐 波

(1.麗江師范高等?？茖W(xué)校應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，云南 麗江，674199；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明，650224)

滇西北地處青藏高原至云貴高原的過渡帶上，包括云南省迪慶州、怒江州、麗江市、大理州和保山市等18個縣(市、區(qū))，面積達(dá)79800 km2[1-2]。該地區(qū)具有典型的高山峽谷垂直景觀、高山濕地生態(tài)系統(tǒng)和溫性、寒溫性針葉林生態(tài)系統(tǒng)等，植物資源豐富，有種子植物6559種，約占云南地區(qū)種子植物的41%，全國種子植物的20%[3]，被稱為中國植物多樣性最豐富的地區(qū)之一[2,4]，同時也是自然災(zāi)害頻發(fā)、水土流失嚴(yán)重的生態(tài)脆弱區(qū)[5]。因此，該地區(qū)是植物區(qū)系組成、物種多樣性保護(hù)、植物資源開發(fā)利用等研究的熱點區(qū)域，目前研究主要集中于資源調(diào)查[2]、植物區(qū)系多樣性[6-7]、部分類群核型報道[8]等方面，居群水平的細(xì)胞學(xué)研究卻鮮見報道。

細(xì)胞學(xué)研究可以為植物區(qū)系起源、系統(tǒng)進(jìn)化、物種多樣性分析提供新資料[9-10]，通過居群水平的遺傳和變異研究，為親緣關(guān)系、育種、種質(zhì)資源鑒定等方面提供一定依據(jù)[11-13]。鑒于上述原因，本研究選取報春花科(Primulaceae)報春花屬(PrimulaL.)偏花報春(P.secundifloraFranch)和灰?guī)r皺葉報春(P.forrestiiBalf. f.)、桔?？?Campanulaceae)藍(lán)鐘花屬(CyananthusWall. ex Benth.)美麗藍(lán)鐘花(C.formosusDiels.)、百合科(Liliaceae)蔥屬(AlliumL.)多星韭(A.wallichiiKunth)等4種滇西北著名高山野生花卉資源為研究材料，開展細(xì)胞學(xué)研究。為滇西北地區(qū)4種植物居群間的差異分化、種質(zhì)資源挖掘利用、生態(tài)多樣性保護(hù)等方面提供基礎(chǔ)證據(jù)，同時也補(bǔ)充完善該地區(qū)植物的細(xì)胞學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料均采自滇西北地區(qū)(表1)。憑證標(biāo)本保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館(KUN)和麗江師范高等?？茖W(xué)校，永久封片保存于云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物室。

表1 材料采集信息Table 1 Samples and their locality information

1.2 方法

采用植物根尖常規(guī)壓片觀察[14]、KaryoType 2.0軟件測量[15]、李懋學(xué)和陳瑞陽核型分析標(biāo)準(zhǔn)[16]及核型不對稱性系數(shù)AI值計算法開展研究工作[17]。試驗流程主要包括種子萌發(fā)、取材料、預(yù)處理、固定、解離、染色、鏡檢和綜合分析等8個環(huán)節(jié)。①種子萌發(fā)：將種子放置于培養(yǎng)基上，置于23～26℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)；②取材料：定期觀察種子，并在種子根尖長至1.2～1.8 cm時取下材料；③預(yù)處理：用0.002 mol/ L 的8-羥基喹啉處理液常溫下避光預(yù)處理1.5～3.5 h；④固定：將材料放置于4℃冰箱中并用卡諾固定液固定處理4～8 h；⑤解離：用1 mol/L鹽酸在60℃水浴鍋中解離6～20 min；⑥染色：卡寶品紅染色液染色12～24 h；⑦鏡檢：制作臨時裝片，顯微鏡下觀察并拍照記錄；⑧綜合分析：選取5個以上中期染色體分散較好的細(xì)胞測量并運用SPSS Statistics 22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。

通過查閱植物染色體信息相關(guān)數(shù)據(jù)庫Tropicos-Index to Plant Chromosome Numbers和Chromosome Counts Database[18-19]，選取核型參數(shù)相對完整的居群進(jìn)行對比分析，從細(xì)胞染色體水平上對滇西北4種植物不同居群間的差異分化進(jìn)行討論。

2 結(jié)果和分析

2.1 偏花報春P. secundiflora Franch

該試驗材料采自香格里拉市中鄉(xiāng)公路邊的云冷杉林下，體細(xì)胞染色體數(shù)目為22條，中期染色體全由中部著絲粒染色體組成，核型公式為2n=2x=22=22m；核型不對稱性劃分類型為Stebbins's-1B型。染色體長度值在1.91～4.74 μm之間變化；染色體平均長度值為3.21 μm；著絲粒指數(shù)CI值為41.88，不對稱系數(shù)AI值為2.91。核型特征及指標(biāo)參數(shù)詳見表2和表3，植物形態(tài)圖見圖1中A1，體細(xì)胞分裂間期、前期、中期染色體形態(tài)圖和核型模式圖見圖1中A2～A5。

表2 4種植物的染色體參數(shù)Table 2 Chromosome parameters of four species

2.2 灰?guī)r皺葉報春P. forrestii Balf. f.

該試驗材料采自麗江市玉龍雪山黑水河的河邊云冷杉林下，體細(xì)胞染色體數(shù)目為24條，中期染色體由11條中部著絲粒染色體和1條近中部著絲粒染色體組成，核型公式為2n=2x=24=22m+2sm；核型不對稱性劃分類型為Stebbins′s-1B型。染色體長度值在4.96～11.62 μm之間變化；染色體平均長度值為8.08 μm；著絲粒指數(shù)CI值為41.69，不對稱系數(shù)AI值為3.99。核型特征及指標(biāo)參數(shù)詳見表2和表3，植物形態(tài)圖見圖1中B1，體細(xì)胞分裂間期、前期、中期染色體形態(tài)圖和核型模式圖見圖1中B2～B5。

表3 滇西北4種植物不同居群的核型參數(shù)Table 3 Cytolotical characteristics of different populations of four species in Northwest Yunnan

表3 滇西北4種植物不同居群的核型參數(shù)Table 3 Cytolotical characteristics of different populations of four species in Northwest Yunnan

圖1 4種植物的形態(tài)、間期核、有絲分裂前期和中期染色體及核型模式圖Fig. 1 Morphology and cytological features four species注：A1-A5：偏花報春；B1-B5：灰?guī)r皺葉報春；C1-C5：美麗藍(lán)鐘花；D1-D5：多星韭。標(biāo)尺=5 m

2.3 美麗藍(lán)鐘花C. formosus Diels.

該試驗材料采自香格里拉市格咱鄉(xiāng)翁水的高山流石灘，體細(xì)胞染色體數(shù)目為12條，中期染色體由5條中部著絲粒染色體和1條近中部著絲粒染色體組成，核型公式為2n=2x=12=10m+2sm；核型不對稱性劃分類型為Stebbins’s-1B型。染色體長度值在1.46～4.17 μm之間變化；染色體平均長度值為2.47 μm；著絲粒指數(shù)CI值為38.36，不對稱系數(shù)AI值為5.63。核型特征及指標(biāo)參數(shù)詳見表2和表3，植物形態(tài)圖見圖1中C1，體細(xì)胞分裂間期、前期、中期染色體形態(tài)圖和核型模式圖見圖1中C2～C5。

2.4 多星韭A. wallichii Kunth

該試驗材料采自麗江市玉龍雪山高山植物園的云冷杉林下，體細(xì)胞染色體數(shù)目為14條，中期染色體由3條中部著絲粒染色體和4條近中部著絲粒染色體組成，核型公式為2n=2x=14=6m+8sm；核型不對稱性劃分類型為Stebbins’s-2A型。染色體長度值在6.276～10.16 μm之間變化；染色體平均長度值為8.25 μm；著絲粒指數(shù)CI值為36.68，不對稱系數(shù)AI值為3.12。核型特征及指標(biāo)參數(shù)詳見表2和表3，植物形態(tài)圖見圖1中D1，體細(xì)胞分裂間期、前期、中期染色體形態(tài)圖和核型模式圖見圖1中D2～D5。

3 討論

報春花屬約有500種，研究表明沿喜馬拉雅山兩側(cè)和云南、四川西部是報春花屬的現(xiàn)代分布中心，該屬植物花多艷麗，是世界著名的高山花卉，因此主要用于栽培觀賞[1,20]。據(jù)統(tǒng)計，已有185種報春花屬植物有染色體數(shù)目的相關(guān)報道，可以確定染色體數(shù)目范圍為16～198條；染色體基數(shù)包括x=8，9，10，11，12等，其中以x=9 和 11最為普遍；倍性水平為2n=2x，4x，6x，8x，14x等，其中以二倍體較為普遍，占比高達(dá)該屬已報道種數(shù)的59.10%[21]。在我們的研究中，偏花報春染色體數(shù)目為2n=22，灰?guī)r皺葉報春染色體數(shù)目為2n=24，染色體數(shù)目在前人研究結(jié)果范圍內(nèi)；從而可以確定，這兩種觀賞植物的染色體基數(shù)分別為x=11和12，均為二倍體；研究結(jié)果也補(bǔ)充支持報春花屬倍性進(jìn)化水平以二倍體為主的觀點。其次，通過統(tǒng)計偏花報春和灰?guī)r皺葉報春兩種植物在滇西北地區(qū)不同海拔梯度下分布居群的染色體核型數(shù)據(jù)[22-24]，發(fā)現(xiàn)在染色體數(shù)目、倍性水平、染色體類型、核型不對稱系數(shù)等核型特征上變化穩(wěn)定，核型類型在1A，1B，2A，2B之間變化。以上兩種植物在滇西北地區(qū)種內(nèi)核型特征變化差異較小的現(xiàn)象，可能是植物在局部地區(qū)對環(huán)境長期適應(yīng)中(2700～4665 m)，已經(jīng)形成穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征。

藍(lán)鐘花屬植物分布于喜馬拉雅山及鄰近地區(qū)，為中國—喜馬拉雅特有屬。在中國主要分布于西藏、云南(滇中、滇西北)、四川(川西)、甘肅和青海等省區(qū)，云南西北部認(rèn)為被是其分布和變異中心[25]。已有報道表明，該屬染色體數(shù)目2n=10，12，14，24，28等，倍性包括2n=2x和4 x，染色體基數(shù)有x=5，6，7[8,26]。此次報道的美麗藍(lán)鐘花翁水居群染色體數(shù)目為2n=12，可確定為二倍體，基數(shù)為x=6。以上結(jié)果與前人報道的香格里拉市石卡山居群相一致[26]，但兩居群在核型類型上有一定的差異(1B和2B型)；同時染色體組成類型也有較大變化，石卡山居群有m、sm和st型，并出現(xiàn)了隨體，而翁水居群僅有m和sm型，也未觀察到隨體出現(xiàn)。依據(jù)《植物志》記載[25]，美麗藍(lán)鐘花在中國主要分布于云南西北部和四川西南部，生于海拔2800～4100 m的山地草坡、林間沙地和林邊碎石地上；而石卡山居群和翁水居群的實驗材料均采自海拔4100～4551 m的高山邊緣帶(流石灘)，高山邊緣帶是陸地上海拔最高的植被帶，生境具有氧氣稀薄、晝夜溫差大、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)日照輻射等特征，生存環(huán)境較為惡劣，只有具備特殊生物學(xué)特性的物種才能定居于此[27]。以上兩居群的核型特征差異似乎也表明，植物染色體結(jié)構(gòu)變化、核型特征分化可能是植物為適應(yīng)環(huán)境而發(fā)生的改變。

多星韭是多年生草本，主要分布于東喜馬拉雅地區(qū)及云貴高原，生于海拔2300～4800 m的草坡、林緣和灌叢下[28]，在滇西北地區(qū)當(dāng)?shù)鼐用裰饕糜谑秤?、藥用和觀賞。已報道的染色體資料表明[29-34]，多星韭染色體數(shù)目2n=14，28，基數(shù)x=7，較為穩(wěn)定，倍性2n=2x，4x。我們的研究結(jié)果與以上報道一致，可以確定玉龍雪山高山植物園居群2n=2x=14，為二倍體。統(tǒng)計的滇西北地區(qū)多星韭21個不同居群中，核型類型為2A型的居群均在2077～3425 m海拔梯度范圍內(nèi)分布，核型類型為3A型的居群僅在海拔為3638 m的香格里拉出現(xiàn)；而在核型組成上存在較大分化，主要表現(xiàn)為染色體類型組成多樣(屬m型、sm型和st型)，隨體和B染色體出現(xiàn)的不規(guī)律性，不對稱系數(shù)AI值變化(在1.58～3.45之間變化)，倍性變化(二倍體單生、四倍體單生、二倍體和四倍體混生等3種類型)等，可以推測滇西北地區(qū)分布的多星韭在居群水平上分化較為劇烈。在海拔梯度與倍性水平變化方面，二倍體居群的海拔分布梯度為2100～3638 m，四倍體居群的海拔分布梯度為2077～3245 m，二倍體的生態(tài)分布幅度更大；結(jié)合AI值變化，二倍體居群為1.58～3.45，四倍體居群為1.61～2.79，依據(jù)Stebbins“核型對稱—原始，核型不對稱—更進(jìn)化”的原理[35]，二倍體不對稱系數(shù)變幅大于四倍體的不對稱系數(shù)(1.58<1.61<2.79<3.4)，以上結(jié)果支持前人[30]提出的多星韭二倍體可能來自同一個祖先，在從高海拔向低海拔方向發(fā)展的過程中，為了適應(yīng)新環(huán)境，二倍體開始出現(xiàn)分化，新的四倍體也逐漸形成的推論。其次，隨體出現(xiàn)的居群分布海拔范圍為2077～3638 m，無隨體的居群分布海拔范圍為2470～3425 m，有學(xué)者認(rèn)為隨體的出現(xiàn)是染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的形態(tài)表現(xiàn)，其數(shù)目可能與植物所處的海拔有關(guān)[36]，這似乎也說明隨體的出現(xiàn)使植物適應(yīng)更廣闊的生態(tài)分布。當(dāng)然，要弄清楚這一熱點地區(qū)中分布海拔與隨體、倍性變化、B隨體等核型特征的相關(guān)性，需要對多居群、多類群系統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)研究。

致謝中國科學(xué)院昆明植物研究所高山植物多樣性研究組提供實驗種子，劉德團(tuán)先生、段芳芳女士提供幫助，在此一并致謝。