張曉千 梁麗娜 付金芳 談秀鳳 范明松

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 鄭州450064； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海201203； 3.上海雷允上藥業(yè)有限公司， 上海201401）

厚樸作為臨床上廣泛使用的中藥［1?2］，其主要活性成分厚樸酚具有中樞神經(jīng)抑制、中樞性肌肉松弛、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、治療心肌損傷等多種藥理作用［3?5］，但該化合物體內(nèi)生物利用度較低［6］，故促進其體內(nèi)吸收、提高其生物利用度是急需解決的問題。聚乳酸?羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種具有良好生物相容性的高分子聚合物，在體內(nèi)可最終代謝成二氧化碳和水，其納米?？商岣咚幬矬w內(nèi)穩(wěn)定性［7］，延長藥物體內(nèi)滯留時間，增加藥物透膜吸收能力［8］，從而改善其生物利用度［7，9?10］。因此，本實驗制備厚樸酚PLGA 納米粒，并考察其粒徑、Zeta 電位、包封率、載藥量、體外溶出、體內(nèi)藥動學(xué)，以期為今后相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

QUINTX224?1CM 型電子天平［賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司］；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；VORTEX?2 型渦旋混合器（上海達姆實業(yè)有限公司）；Nanosep? 超濾離心管（截留分子量10 000 Da，美國Pall 公司）；79?1 型溫控磁力攪拌器（常州金壇良友儀器有限公司）；JY92?Ⅲ型超聲波細胞粉碎機（寧波新知科儀器研究所）；RC?80 型智能溶出儀（蘇州奇樂電子科技有限公司）；FD10?QX型真空凍干機（上海精密儀器有限公司）；Master?sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；UGC?24C 型氮氣吹掃儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

厚樸酚對照品（批號150520，純度99.2%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；葛根素對照品（批號110752?160913，純度98%，中國食品藥品檢定研究院）。聚乳酸?羥基乙酸共聚物（PLGA，批號20160312，分子量55 000 Da，聚乳酸與聚羥基乙酸比例50 ∶50，濟南岱罡生物材料有限公司）；0.5%聚乙烯醇（PVA，批號WPE1566D，分子量20 000～30 000 Da，比利時Acros 公司）。透析袋（美國Sigma 公司，截留分子量8 000～14 000 Da）。清潔級SD 大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2016?0001，在實驗室環(huán)境下適應(yīng)1 d 后開始正式研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸酚含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相乙腈?四氫呋喃?1.0%冰醋酸（15 ∶1 ∶84）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取厚樸酚對照品50 mg，溶于50 mL 乙腈中作為貯備液（1.0 mg／mL），精密量取4.0 mL 至50 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，即得對照品溶液（80.0 μg／mL），乙腈依次稀釋 至40.0、10.0、1.0、0.2、0.05 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝1.623 5X-0.790 8（r＝0.999 6），在0.05～80.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 方法學(xué)考察 取 “2.1.2” 項下0.05、40.0、80.0 μg／mL 對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚峰面積RSD 分別為0.62%、0.25%、0.13%，表明儀器精密度良好。取2.0 mL 厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙海糜?0 mL量瓶中，4 mL 二氯甲烷超聲破乳后乙腈定容至刻度，10 000 r／min 離心30 min，取上清液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚峰面積RSD 為1.15%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。平行制備6 份厚樸酚PLGA納米粒溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚含有量RSD 為1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。取“2.1.2” 項下貯備液4 mL，乙腈定容至10 mL，即得對照品溶液（400.0 μg／mL），取2.0 mL空白PLGA 納米?；鞈乙褐?0 mL 量瓶中，平行9 份，加入上 述對照 品溶液0.5、1.0、2.0 mL各3 份，加入4 mL 二氯甲烷超聲后乙腈定容至刻度，10 000 r／min 離心30 min，取上清液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚平均加樣回收率分別為98.66%、100.27%、100.02%，RSD 分別1.63%、1.24%、0.96%。

2.2 厚樸酚PLGA 納米粒及其凍干粉制備

2.2.1 納米粒 稱取厚樸酚10 mg、PLGA 150 mg，溶于15 mL 二氯甲烷中，作為油相；吸取0.5%PVA 溶液40 mL，作為水相，置于磁力攪拌器上，800 r／min 攪拌一段時間，將油相逐滴加到水相中，滴完后超聲（150 W）處理5 min（每超聲2 s 間隔1 s），得到初乳，減壓旋蒸揮去有機溶劑，迅速置于-4 ℃冰箱中固化，即得，并制成混懸液。同法制備空白PLGA 納米?；鞈乙骸?/p>

2.2.2 凍干粉 將厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙悍殖扇舾煞荩?2 000 r／min 離心20 min，棄去上清液，收集沉淀，蒸餾水定容至40 mL，加入3%甘露醇作為凍干保護劑，-60 ℃下預(yù)凍36 h 后抽真空，冷凍干燥48 h，即得。

2.3 載藥量、包封率測定 采用超濾離心法。取2.0 mL 厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙褐?0 mL 量瓶中，4 mL 二氯甲烷超聲破乳后，乙腈定容至刻度，8 000 r／min 離心30 min，取上清液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算厚樸酚總含有量m總；精密量取2.0 mL 納米?；鞈乙褐脸瑸V離心管中（截留分子量30 kDa），12 000 r／min 離心20 min，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算游離厚樸酚含有量m游離。再計算載藥量、包封率，公式分別為載藥量＝ ［（m總-m游離）／（m總＋m納米粒）］×100%、包封率＝ ［（m總-m游離）／m總］×100%，其中m納米粒為納米粒總質(zhì)量。

按“2.2” 項下方法平行制備3 批厚樸酚PLGA 納米粒及其凍干粉，測得前者平均包封率為（75.36±0.38）%，載藥量為（4.61±0.27）%；后者包封率下降至（71.02±0.41）%，載藥量下降至（4.42±0.32）%，質(zhì)量分數(shù)為0.51%（以厚樸酚計）。

2.4 形態(tài)觀察 取適量厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙?，2%磷鎢酸溶液染色后置于透射電鏡（TEM）下觀察其基本形態(tài)，結(jié)果見圖1。由此可知，納米粒子之間無粘連，基本呈球形或類球形。

圖1 納米粒TEM 圖Fig.1 TEM image for nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta 電位測定 取3 份厚樸酚PLGA納米?；鞈乙?，每份100 μL，超純水稀釋40 倍后測定粒徑、Zeta 電位，超純水復(fù)溶其凍干粉后也同法測定，結(jié)果見表1。由此可知，與納米粒比較，其凍干粉粒徑升高，Zeta 電位絕對值降低。

表1 凍干前后納米粒平均粒徑、Zeta 電位測定結(jié)果（n＝3）Tab.1 Results of average particle size and Zeta potential determination of nanoparticles before and after lyophilization（n＝3）

2.6 體外釋藥研究 采用透析袋法。取厚樸酚PLGA 納米粒凍干粉和原料藥（含5 mg厚樸酚），加入3 mL 0.5%SDS 溶液制備混懸液，轉(zhuǎn)移至透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），兩端尼龍繩扎緊，設(shè)定溶出儀轉(zhuǎn)速、溫度分別為100 r／min、（37±1）℃，以900 mL 0.5%SDS 溶液為釋放介質(zhì)，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h 各自動取樣2 mL，并補加2 mL 蒸餾水以保持總體積不變，溶液離心（4 000 r／min）20 min 后，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖2，可知納米粒在前4 h 釋藥較快，之后趨于平穩(wěn)。再分別采用零級、一級、Weibull、Higuchi 方程進行擬合，發(fā)現(xiàn)Weibull 方程擬合效果最好（R2＝0.978 3）。

2.7 藥動學(xué)研究

圖2 樣品體外釋藥曲線Fig.2 In vitro drug release curves for samples

2.7.1 給藥及血樣采集 取大鼠12 只，隨機分為2 組，給藥前禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給予厚樸酚及其PLGA 納米?；鞈乙海? mg／mL），給藥劑量50 mg／kg（以厚樸酚計）。乙醚麻醉大鼠后，用肝素浸潤的玻璃毛細管于0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、10、12 h 眼眶后靜脈叢采血各0.2～0.3 mL，置于肝素浸潤的離心管中，立即用棉球覆蓋在取血眼眶處止血。血液在2 500 r／min下離心2 min 后，取上層血漿，低溫保存。

2.7.2 血漿樣品處理 精密稱取葛根素對照品10 mg，溶 于 100 mL 乙腈中，乙腈稀釋至200 ng／mL，即得內(nèi)標溶液。精密吸取 “2.7.1”項下解凍后血漿200 μL、內(nèi)標溶液100 μL 于離心管中，加入1.0 mL 乙酸乙酯渦旋振蕩3 min，靜置1 min 后，繼續(xù)渦旋振蕩3 min，3 000 r／min 離心3 min后，取上層有機相，45 ℃下氮氣吹干，加入200 μL 乙腈，8 000 r／min 離心5 min，取20 μL上清液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.7.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2” 項下1.0 μg／mL 對照品溶液適量，乙腈依次稀釋至800、500、100、50、20 ng／mL，各精密量取200 μL，與100 μL 內(nèi)標溶液置于同一離心管中，45 ℃氮氣吹干，加入200 μL 空白血漿渦旋5 min，取20 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），厚樸酚、內(nèi)標（葛根素）峰面積比值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝0.079 12X＋0.008 4（r＝0.992 2），在20～1 000 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、空白血漿＋對照品＋內(nèi)標（按“2.7.3” 項下方法制備）、處理后血漿樣品（按“2.7.2” 項下方法制備）溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖3。由此可知，厚樸酚與內(nèi)標分離度較高，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，表明該方法專屬性良好。

圖3 厚樸酚HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of magnolol

取處理后血漿樣品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、12、24、36 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚含有量RSD 為9.67%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.7.3” 項下20、500、1 000 ng／mL 空白血漿＋對照品＋內(nèi)標溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得厚樸酚含有量RSD 分別為1.83%、0.82%、0.71%，表明儀器精密度良好。取 “2.7.3” 項下800、500、100 ng／mL 對照品 溶液各200 μL，加 入100 μL內(nèi)標溶液，氮氣吹干后加入200 μL 空白血漿重新溶解，按 “2.7.2” 項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定3 次，測得厚樸酚平均加樣回收率分別為95.18%、90.83%、91.66%，RSD 分別為8.43%、5.69%、7.10%。取20 ng／mL 對照品溶液，乙腈逐步稀釋，測得定量限（S／N＝10）為12 ng／mL，檢測限（S／N ＝3）為5 ng／mL。

2.7.5 結(jié)果 圖4、表2 顯示，納米粒tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥（P＜0.05，P＜0.01），并且相對生物利用提高至2.17 倍。

圖4 樣品血藥濃度?時間曲線Fig.4 Plasma concentration?time curves for samples

表2 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

表2 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

注：與厚樸酚比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

在藥動學(xué)研究中，血漿樣品的處理方法對實驗結(jié)果準確性有較大影響。課題組前期曾先用甲醇、乙腈等沉淀蛋白，再用乙酸乙酯萃取，但發(fā)現(xiàn)樣品回收率僅為54.11%～68.79%；用乙酸乙酯直接萃取時，回收率反而升至90.69%～95.42%。研究表明，厚樸酚與血漿蛋白之間可能會產(chǎn)生靜電作用力、氫鍵作用力等，導(dǎo)致有機溶劑沉淀蛋白時厚樸酚與血漿蛋白結(jié)合較緊密［11］。因此，最終確定處理方法為乙酸乙酯直接萃取，而且操作過程大大簡化。

厚樸酚生物利用度低，可能與其水溶性差、透膜吸收能力有限、穩(wěn)定性不理想等因素有關(guān)［12?15］，將其制成PLGA 納米粒后，tmax顯著延長，Cmax顯著升高，相對生物利用度提高至2.17 倍。其中，tmax延長的原因一方面與納米粒易吸附在胃腸道黏膜而增加滯留時間有關(guān)，另一方面也與PLGA 聚合物納米粒子緩釋作用相關(guān)；Cmax、相對生物利用度升高的原因是由于納米粒比表面積明顯變大，增加了藥物與胃腸道的接觸面積，而且它可在胃腸道中與具有淋巴結(jié)構(gòu)的Peyer’ s parches 聚集，通過M 細胞進入血液循環(huán)，從而促進藥物高效吸收［16?20］。但厚樸酚PLGA 納米?？诜锢枚鹊奶岣叱潭冗€受到酶解、制劑穩(wěn)定性、透膜吸收能力等因素的影響［10］，可能會導(dǎo)致體內(nèi)外相關(guān)性不一致。另外，PLGA 納米粒注射后還會受到網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞清除、單核巨噬細胞吞噬等因素的作用，其絕對生物利用度的提高程度仍有待進一步研究［21］。