湯葆莎，賴譜富，李怡彬，吳 俐，翁敏劼，鄭恒光

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】芙蓉李是福建李果產(chǎn)業(yè)的主栽品種，也是主要的李果加工品種（占95%以上），在永泰、福安、屏南、永安等地均有大面積種植，單永泰一縣的種植面積就達9133.33 hm2[1]。芙蓉李成熟期主要集中在6～7 月，采摘周期短，且易腐、不易較長時間保藏，主要被加工成李干、蜜餞類產(chǎn)品，造成芙蓉李加工產(chǎn)業(yè)存在產(chǎn)品單一、產(chǎn)品附加值低、經(jīng)常供過于求等困境，影響產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[1]。鑒于芙蓉李果實營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、可溶性糖、有機酸（主要為蘋果酸[2-3]）等，特別是含有花色苷等酚類活性物質(zhì)[4-5]，利用芙蓉李果實中的多酚物質(zhì)開發(fā)咀嚼片類功能食品潛力大，開展芙蓉李咀嚼片酚類物質(zhì)及其生物活性研究可為產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)，賦予產(chǎn)品營養(yǎng)健康新概念。【前人研究進展】前人對紅棗藕節(jié)[6]、五味子[7]、藍(lán)莓復(fù)方[8]、即食型復(fù)方黃精[9]和麥麩膳食纖維[10]咀嚼片的抗氧化能力進行研究，得出各種咀嚼片均有提高機體抗氧化能力的作用。芙蓉李屬于高多酚含量的李果品種，果實中兒茶素的含量高達295.89 mg·kg-1[11]，而植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的抗氧化劑，有抗氧化、預(yù)防癌癥和心血管疾病、抑菌消炎和抗病毒等作用，是一種具有獨特生理活性和藥理活性的次生代謝天然產(chǎn)物[12-14]。同時，也有學(xué)者對蔬菜醇提物[15]、谷物雜糧醇提物[16]和幾種天然產(chǎn)物[17]等物質(zhì)對黃嘌呤氧化酶XOD 的抑制性進行了研究?！颈狙芯壳腥朦c】筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)芙蓉李多酚提取物具有抗氧化和抑制黃嘌呤氧化酶XOD 活性的作用[18]。但目前尚未有針對芙蓉李加工產(chǎn)品酚類物質(zhì)組分及含量和生物活性的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以選定的芙蓉李加工產(chǎn)品咀嚼片為樣本，分析產(chǎn)品酚類物質(zhì)組分及含量，探討其體外抗氧化和輔助降尿酸的能力，以期為芙蓉李加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

芙蓉李果粉制備：芙蓉李果經(jīng)清洗、去核、切片后，采用熱泵干燥機60 ℃干燥、粉碎而成。

芙蓉李多酚粉制備：取芙蓉李果粉，利用超聲波輔助乙醇提取（60%乙醇、超聲時間30 min、提取溫度50 ℃）后，減壓濃縮（-0.098 MPa，50 ℃）去乙醇，并將芙蓉李多酚溶液濃縮至17%，4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?；利用噴霧干燥法制備芙蓉李多酚粉，選用麥芽糊精∶β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠=7∶2∶1 作為壁材，噴霧干燥參數(shù)：芯材壁材比為1∶4，進風(fēng)溫度為130 ℃，進料固形物含量為15%，進料流量300 mL·h-1；制備的芙蓉李多酚粉呈紫紅色。

麥麩菌粉制備[10]：以面粉廠直接購置的麥麩為發(fā)酵基質(zhì)、食用菌秀珍菇（Pleurotus geesteranus）-XJ為發(fā)酵菌株，采用固液多級優(yōu)化培養(yǎng)方式獲得秀珍菇液體菌種，麥麩基質(zhì)固體培養(yǎng)的最終含水量為120%（其中接種量為30%），于培養(yǎng)箱中27 ℃遮光培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)基質(zhì)，之后50～60 ℃熱風(fēng)烘干至恒重，再粉碎至100～200 目而制得麥麩菌粉（其膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)達40.14%）。

阿拉伯膠（食品級）：上海權(quán)旺生物科技有限公司；麥芽糊精（食品級）：DE=12，石家莊華辰淀粉糖生產(chǎn)有限公司；β-環(huán)糊精（食品級）：江蘇豐園生物技術(shù)有限公司；微晶纖維素等其他輔料皆為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

SY6000 小型噴霧干燥儀（上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司）、KQ-600DV 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司）、765P 紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、CJY-300C 型智能片劑脆碎度測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）、YPD-300D 型片劑硬度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）、ZB-1G 型智能崩解儀（天津海益達科技有限公司）、ZP9A 型旋轉(zhuǎn)式壓片機（上海天凡藥機制造廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 芙蓉李咀嚼片制備工藝流程[10，19-20]芙蓉李咀嚼片制備工藝流程如下：原料→混合→攪拌均勻→壓片→質(zhì)量檢驗→包裝→成品。

前期項目組對芙蓉李咀嚼片配方已做了大量的篩選試驗，試驗發(fā)現(xiàn)，芙蓉李果粉和芙蓉李多酚粉由于易受潮，直接壓片制成咀嚼片太僵硬，不好咀嚼，且原料的流動性差。為改善原料的流動性，提高咀嚼片的質(zhì)量，須在添加15%～20%麥麩菌粉、10%微晶纖維素、5%～10%麥芽糊精的條件下，才能使制作咀嚼片的粉末原料的流動性、可壓性和潤滑性達到片劑制備的要求。本試驗只將與酚類物質(zhì)相關(guān)的芙蓉李咀嚼片配方納入研究中，制作芙蓉李咀嚼片的步驟為：首先按配方將所需的每種原料和輔料粉稱量好；其次按1∶1 比例、以從少到多的順序進行粉料的混合，分批次混合完畢后再混合均勻；然后將混合均勻的粉末放入高速旋轉(zhuǎn)式壓片機中壓片，制成成品。

1.3.2 片質(zhì)量、崩解時限、硬度及脆碎度測定[10，19-20]片質(zhì)量測定：取樣品20 片，分別精密稱定，計算平均片質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)差。

崩解時限測定：取樣品3 片，分別置于智能崩解儀的吊籃玻璃管中，每管各放一分散后記錄每片崩解的時間，取平均值為其崩解時限。

硬度測定：取6 片芙蓉李咀嚼片，在片劑硬度儀上分別對片劑硬度進行測定，以其平均值為最終片劑硬度指標(biāo)。

脆碎度測定：取10 片芙蓉李咀嚼片，用風(fēng)機吹去其外表粉末，稱取質(zhì)量后，放置于脆碎度測定儀中轉(zhuǎn)動100 次，取出后再用同法除去外表粉末，稱取其質(zhì)量，計算出脆碎度。

1.3.3 芙蓉李咀嚼片提取液制備 將芙蓉李咀嚼片搗碎，按料液比[咀嚼片物料質(zhì)量（g）∶乙醇溶液體積（mL）]1∶30 的比例，在帶塞的三角瓶中加入咀嚼片和60%乙醇（V / V），以提取時間60 min、功率420 W、溫度50 ℃的參數(shù)為條件，于超聲波清洗器中進行提取，之后將提取液抽濾、濃縮至無醇味后，制備得到咀嚼片提取液，密封，置于4 ℃冰箱備用。咀嚼片提取液用于測定多酚含量、清除DPPH自由基和羥自由基能力及XOD 抑制活性，以固形物含量標(biāo)定其濃度。

1.3.4 總多酚及總黃酮含量測定[21-22]以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Foin-Ciocaheu 法測定總多酚含量。取200 μL 樣品，加入2.5 mL 10%（V / V）福林酚溶液，搖勻后，在室溫下遮光放置2 min，再加入2 mL質(zhì)量濃度為75 g·L-1的Na2CO3溶液，混勻，用蒸餾水定容后，于50 ℃水浴鍋中水浴15 min，快速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，在分光光度計波長765 nm處檢測吸光度值?？偠喾淤|(zhì)量濃度以每毫升樣液中所含的沒食子酸當(dāng)量（mg·mL-1）表示。

采用硝酸鋁比色法測定芙蓉李咀嚼片中總黃酮含量。

1.3.5 酚類物質(zhì)測定[23]采用高效液相色譜法測定。色譜條件：C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm；流動相：A 為2%甲酸溶液，B 為乙腈，用前過0.45 μm 濾膜脫氣；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：280、320、360 nm；進樣量：10 μL。

1.3.6 清除DPPH 自由基能力測定[18]將溶解于甲醇中 的5 mL 100 μmol·L-1DPPH 添 加 到1 mL 提 取 物中，再將其重新懸浮于蒸餾水中?；旌暇鶆蚝螅瑢⒒旌衔镬o置暗中25 ℃放置30 min。使用分光光度計在波長517 nm 處測定吸光度，以未添加DPPH 溶液的樣品為空白對照。按以下公式計算清除DPPH 自由基的能力：

抗氧化能力（抑制率，%）= [（Ac－As）/Ac]×100，其中Ac是對照品（不含DPPH 溶液樣品）的吸光度值；As是測試樣品的吸光度值。

1.3.7 清除羥自由基能力的測定[18，24]取1.0 mL 的0.15 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）、2 mL 的 0.52 mg·mL-1番 紅 溶 液、1.0 mL 的6 mmol·L-1EDTA-Na2-Fe2＋和0.5 mL 的樣液，混合搖勻后加入0.8 mL 的0.3% H2O2，立即置于40 ℃水浴鍋中水浴30 min，空白組用等體積的超純水代替樣品溶液，對照組為等體積超純水代替樣液和H2O2溶液；之后于分光光度計波長520 nm 處測定吸光度A。清除羥自由基的能力根據(jù)以下公式計算：

羥自由基清除能力/%=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100，其中As、Ab和Ac是測試樣品、空白組和對照組的吸光度值。

1.3.8 XOD 抑制活性測定[22，25]取少量凍干后的多酚樣品用二甲基亞砜（DMSO）溶解，再用0.2 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液稀釋至不同濃度，在酶標(biāo)板中依次加入50 μL 樣品與150 μL 0.4 mmol·L-1的黃嘌呤，35 ℃下保溫5 min，再加入50 μL 0.05 U·mL-1的XOD，搖勻放置25 min 后，用80 μL 1 mol·L-1的HCL 終止反應(yīng)；每個樣品3 個平行，以磷酸緩沖鹽溶液作為空白對照。取反應(yīng)液以超純水稀釋10 倍，用0.25 μm水性膜過濾后，用高效液相色譜法檢測尿酸生成量，以250 nm×4.6 mm×5 μm 的 C18柱為色譜柱，其余色譜液相條件為流動相：甲醇-0.015 mol·L-1磷酸二氫胺溶液（15∶85）、檢測波長295 nm、運行時間10 min、流速0.8 mL·min-1、進樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生產(chǎn)配方對芙蓉李咀嚼片感官品質(zhì)和物理特性的影響

在前期試驗基礎(chǔ)上，設(shè)置2 個與酚類物相關(guān)的咀嚼片配方，按1.3.1 的流程制作咀嚼片，考察2 種配方對芙蓉李咀嚼片感官品質(zhì)和物理特性的影響。從表1 可以看出，原料中增加或減少芙蓉李果粉、減少或增加麥麩菌粉的比例，咀嚼片的片重、脆碎度和崩解時限無明顯差異，感官風(fēng)味變化不大，但芙蓉李果粉添加多、麥麩菌粉添加少就會使產(chǎn)品硬度增大，咀嚼后粘牙程度加劇，這可能是由于芙蓉李果粉含有蔗糖、果糖等糖類物質(zhì)，而麥麩菌粉膳食纖維含量較高，可增大原料流動性的緣故。

表1 不同配方的各項檢測指標(biāo)Table 1 Testing criteria on ingredients for tablet formulation

色澤是感官評價食品品質(zhì)的一個重要因素，盡管芙蓉李果粉的比例增加，咀嚼片紅綠值a*升高（增加了3.92%）、亮度L*和黃藍(lán)值b*降低，但差異不顯著，2 種咀嚼片均呈紫紅色。綜合咀嚼片物理特性和感官質(zhì)量，選擇配方B 作為本研究檢測樣本的芙蓉李咀嚼片生產(chǎn)配方。

2.2 芙蓉李咀嚼片酚類物質(zhì)分析

根據(jù)上述優(yōu)化配方制備出的芙蓉李咀嚼片，其酚類物質(zhì)如表2 所示。咀嚼片中酚類物質(zhì)含量達到0.630 8%，主要以黃酮類物質(zhì)為主，占酚類物質(zhì)的83.04%；咀嚼片中花色苷含量有4.354 6 mg·hg-1，這可能是咀嚼片呈紫紅色原因。咀嚼片中還含有表兒茶素、原花青素、兒茶素、原花青素B 等酚類單體，其中表兒茶素的含量最高（53.423 9 mg·hg-1）、原花青素次之（12.849 mg·hg-1）。

2.3 芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基能力

DPPH 被廣泛用于定量測定天然產(chǎn)物和生物活性成分的抗氧化能力，芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基能力的試驗結(jié)果見圖1。咀嚼片與Vc 清除DPPH自由基能力都是隨著濃度的升高，清除率增大，呈正相關(guān)的量效關(guān)系；而質(zhì)量濃度在0.16 mg·mL-1時，芙蓉李咀嚼片與Vc 清除DPPH 自由基的能力無明顯差異。芙蓉李咀嚼片DPPH 自由基清除率的IC50值為0.07 mg·mL-1，接近于Vc 的IC50值0.064 mg·mL-1，表明芙蓉李咀嚼片與Vc 有相同的DPPH 自由基清除能力。

表2 芙蓉李咀嚼片的酚類物質(zhì)分析Table 2 Phenols in chewable plum tablets

2.4 芙蓉李咀嚼片清除羥基自由基能力

圖1 芙蓉李咀嚼片的DPPH 自由基清除能力Fig.1 Scavenging ability on DPPH free radicals of chewable plum tablets

羥基自由基是最活潑的活性氧自由基之一，容易與生物分子反應(yīng)，引起組織損傷或細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致機體的衰老和疾病。由圖2 可知，芙蓉李咀嚼片提取液能有效清除羥基自由基，清除率隨濃度增加而顯著提高（P＜0.05），且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)；當(dāng)兩者質(zhì)量濃度為0.9～1.5 mg·mL-1時，芙蓉李咀嚼片清除羥基自由基的能力和Vc 相比，有明顯差異；通過清除率擬合曲線，芙蓉李咀嚼片清除羥基自由基的IC50值為0.79 mg·mL-1，略高于對照組Vc 的IC50值0.63 mg·mL-1。說明芙蓉李咀嚼片具有較強的羥自由基清除活性。這可能是由于芙蓉李咀嚼片含有原花青素（12.849 mg·hg-1）、表兒茶素（53.423 9 mg·hg-1）等酚類物質(zhì)。

圖2 芙蓉李咀嚼片的羥基自由基清除能力Fig.2 Scavenging ability on hydroxyl free radicals of chewable plum tablets

2.5 芙蓉李咀嚼片XOD 抑制活性

XOD 是機體嘌呤代謝主要的催化酶，可催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，進而催化發(fā)生氧化產(chǎn)生尿酸；體內(nèi)尿酸濃度過高將導(dǎo)致高尿酸血癥，進而誘發(fā)痛風(fēng)等代謝性疾病，而黃嘌呤氧化酶抑制劑可降低體內(nèi)XOD 的活性，從而減少尿酸生成。芙蓉李咀嚼片的XOD 抑制活性如圖3 所示。隨著濃度的增加，芙蓉李咀嚼片和別嘌呤醇對XOD 的抑制能力也增加。作為陽性對照，別嘌呤醇在低濃度下對XOD 顯示出高抑制活性；芙蓉李咀嚼片在20～1 000 μg·mL-1對XOD 也有一定的抑制作用，400 μg·mL-1的濃度其抑制率達62.12%。檢測得出芙蓉李咀嚼片和別嘌呤醇的IC50分別為258.96 μg·mL-1和7.19 μg·mL-1。

圖3 芙蓉李咀嚼片的黃嘌呤氧化酶抑制能力Fig.3 Xanthine oxidase inhibition ability of chewable plum tablets

3 討論與結(jié)論

本研究以芙蓉李及其多酚提取物為主要原料研制出芙蓉李咀嚼片，咀嚼片配方為芙蓉李果粉40%、芙蓉李多酚粉20%、麥麩菌粉20%、微晶纖維素10%、麥芽糊精10%，制成的咀嚼片顏色呈紫紅色，完整光潔，無裂片分層，邊沿光滑整齊，酸甜可口，硬度適宜，咀嚼性良好。

植物多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，有助于預(yù)防心腦血管和癌癥等疾病的發(fā)生，其抗氧化活性與總酚的含量相關(guān)[26]。有文獻報道花色苷具有強大的抗氧化和清除自由基的能力，對人體微循環(huán)有特殊改善的功效，以高效和高生物利用而著稱[27]；喻秀娟等[28]也已報道李子皮原花青素具有較強清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH·自由基的能力。本研究顯示芙蓉李咀嚼片中酚類物質(zhì)含量達到0.630 8%，主要以黃酮類物質(zhì)為主，含有表兒茶素、原花青素、花色苷等酚類單體，這些元素對抗氧化和清除自由基有一定的作用，芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基和羥基自由基的IC50值分別為0.07 mg·mL-1和0.79 mg·mL-1，與Vc 相當(dāng)，這與Ma 等[29]發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)含量直接影響提取物的DPPH 清除率的研究一致，表明其有較強的抗氧化能力。Li 等[18]的研究也表明，芙蓉李多酚類物質(zhì)能夠直接捕獲活性氧，阻止過氧化過程。由此推測，芙蓉李咀嚼片較好的抗氧化性來源于其豐富的小分子酚類物質(zhì)活性成分。

XOD 是引導(dǎo)尿酸生成的一種重要酶，黃嘌呤氧化酶抑制劑通過抑制XOD 的活性來減少黃嘌呤與次黃嘌呤向尿酸鹽的轉(zhuǎn)化，從本質(zhì)上減少尿酸的生成，來達到治療痛風(fēng)的目的[28-31]。在臨床上抑制XOD的藥物有別嘌呤醇、非布司他等，這些西藥雖然見效快，但副作用大。如別嘌呤醇用后，病人易引起發(fā)熱、腹痛、腹瀉、過敏性皮疹、白細(xì)胞及血小板減少，甚至有可能出現(xiàn)肝功能損害等副作用，因而這些降尿酸西藥應(yīng)用受到明顯限制，從植物尋找副作用小的天然降尿酸藥物或食物是目前研究的熱點[18]；有研究表明茶多酚等天然產(chǎn)物可抑制XOD 介導(dǎo)的尿酸產(chǎn)生[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然芙蓉李咀嚼片XOD抑制活性低于常規(guī)降尿酸藥物別嘌呤醇，但仍有較強的抑制活性（IC50為258.96 μg·mL-1）。因此，本試驗表明芙蓉李咀嚼片具有較好的抗氧化性和黃嘌呤氧化酶抑制活性，為可我國芙蓉李精深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用提供依據(jù)，開發(fā)為抗氧化功能食品和輔助降尿酸功能食品的潛力大。