何深宏，程方俊，羅 干，張 耕，杜亞楠，康霞梅，王曉涵，趙自亮，任紹科，郭建華

（西南大學動物科學學院，重慶 402460）

0 引言

【研究意義】隨著我國養(yǎng)牛業(yè)迅速發(fā)展，傳統(tǒng)分散式養(yǎng)殖模式正逐漸被集約化養(yǎng)殖模式所代替。集約化養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量糞污對環(huán)境造成了巨大危害，并且隨著我國環(huán)境保護力度的不斷加大，牛糞的無害化處理已成為限制我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要因素[1]。牛糞由于纖維素、木質(zhì)素等難降解物質(zhì)含量高、發(fā)酵時間長等原因，導致其開發(fā)利用受到嚴重制約[2-3]。目前，我國牛糞無害化處理的主要方法包括生態(tài)還田法、沼氣發(fā)酵法、堆肥化技術、墊料回用模式等，但由于土地資源、經(jīng)濟效應和安全性等因素，生態(tài)還田、沼氣發(fā)酵、墊料回用模式等方法未能得到廣泛應用[4]。近年來，堆肥化技術因其成本投入較低、肥效較高、安全、易于推廣等優(yōu)點，逐漸成為人們無害化處理牛糞的首要選擇?！厩叭搜芯窟M展】堆肥化技術的主要原理是利用高產(chǎn)纖維素酶微生物對牛糞中纖維素的降解作用[5]。有關研究表明，從環(huán)境中分離得到的降解纖維素的微生物主要包括細菌、真菌和放線菌，其中真菌的降解能力較強，以木霉菌[6]和曲霉菌[7]產(chǎn)生和分泌的纖維素酶系最全面，效果也最佳。細菌降解纖維素的能力與真菌相比雖然稍遜一籌，但其具有繁殖速度快、培養(yǎng)條件簡單、發(fā)酵周期短等特點。劉宇等[8]從玉米青貯飼料樣品中篩選獲得一株具有一定產(chǎn)纖維素酶能力的解淀粉芽孢桿菌。崔海洋等[9]從土壤中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，其羧甲基纖維素酶最高可達307.23 U·mL-1。劉鎖珠等[10]從藏豬糞便中分離得到一株可高效降解纖維素的解淀粉芽孢桿菌?！颈狙芯壳腥朦c】堆肥牛糞中具有較多能夠降解纖維素的細菌，從牛糞堆肥樣品中分離篩選纖維素酶活性高、繁殖速度快、培養(yǎng)條件簡單的降解纖維素優(yōu)勢細菌對實際生產(chǎn)具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】本研究以重慶三峽庫區(qū)3 個牛糞堆肥廠的牛糞為研究對象，采用10 倍稀釋法和平板劃線相結(jié)合的方式分離純化微生物，利用水解圈法作為初篩和羧甲基纖維素（Carboxymethyl cellulose, CMC）酶糖化力法作為復篩，以分離篩選出適合該地區(qū)地理氣候條件的高效分解牛糞中纖維素的微生物，并且通過菌株形態(tài)特征觀察、生理生化和分子生物學方法鑒定其種屬，為重慶三峽庫區(qū)牛糞的快速無害化降解提供優(yōu)勢菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 采用五點采樣法分別從重慶三峽庫區(qū)3 個牛糞堆肥廠采集發(fā)酵第5 d、第15 d、第25 d、第35 d、第45 d 牛糞樣品，放入冰盒后立即送回實驗室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鈉1.2 g，磷酸二氫鉀0.9 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，酵母浸出粉0.5 g，酸水解酪蛋白0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.1[11]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，氯化鈉5.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.1[11]。

1.1.3 主要試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒購于大連寶生物有限公司；細菌生化鑒定管購于杭州濱和微生物試劑有限公司；瓊脂糖購于生工生物工程（上海）股份有限公司；LB 培養(yǎng)基購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化 稱取1 g 樣品懸浮于99 mL 無菌蒸餾水中，充分混合均勻。采用10 倍稀釋法將樣品稀釋成10-4、10-5、10-6等3 個濃度梯度，吸取各濃度梯度稀釋液200 μL 分別涂布于CMC 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取生長良好的單菌落進行純化培養(yǎng)，直至得到純培養(yǎng)物。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩 參照文獻[12]，采用水解圈法進行初篩。將純培養(yǎng)物37 ℃、160 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)16 h 并通過麥氏比濁法將純培養(yǎng)物混懸液稀釋到0.5 個麥氏濃度后，取10 μL 純培養(yǎng)物混懸液點種于CMC 培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)4 d 后，采用0.2%剛果紅染色30 min，用蒸餾水和生理鹽水洗凈染液，再用5%的醋酸固定顏色。每種純培養(yǎng)物進行3 次重復試驗。用游標卡尺測量純培養(yǎng)物菌落直徑（d）與水解圈直徑（D），根據(jù)水解圈直徑和純培養(yǎng)物菌落直徑比值（D/d）篩選出比值大的純培養(yǎng)物進行復篩。

1.2.3 菌株16S rRNA 基因鑒定 以復篩所得純培養(yǎng)物DNA 為模板，16S rRNA 基因通用引物（購于武漢金開瑞生物工程有限公司）進行PCR 擴增。反應體系為：上下游引物各2 μL（0.5 μmol·L-1）、模板DNA 1 μL（100 ng）、ddH2O 20 μL、2×Premix Taq 25 μL。反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR 擴增產(chǎn)物5 μL 進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增所得產(chǎn)物切膠回收送重慶擎科生物公司測序。將測序結(jié)果通過生物信息學軟件MEGA6.0 進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.2.4 菌株復篩 參考DB33/T459-2003 標準，采用CMC 酶糖化力法進行測定。將純培養(yǎng)物接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h 后，按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后菌液置于4 ℃、4 000 r·min-1離心20 min，取上清液（即待測粗酶液）。

取4 支刻度試管（1 支為空白管，3 支為樣品管），分別向4 支試管中準確加入0.5 mL 待測粗酶液（空白管加入粗酶液后沸水浴10 min）。向待測粗酶液樣品管中加入1% CMC 溶液1.5 mL 和向空白管中加入3, 5-二硝基水楊酸（DNS）試劑3 mL，（40±0.2）℃準確水浴反應10 min 后取出，迅速向待測樣品管中加入DNS 試劑3 mL、空白管中加入1% CMC溶液1.5 mL，混勻。沸水浴反應5 min，取出流水迅速冷卻至室溫后，向各試管中加入10 mL 蒸餾水，混勻。以空白管調(diào)分光光度計零點，在波長540 nm處測定各待測樣品酶液吸光度，計算酶活。纖維素酶活力定義為在1 min 內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當于1 μg 葡萄糖的酶量即為1 個酶活力單位，每個樣品做3 次重復試驗。

1.2.5 菌株形態(tài)學觀察及生化鑒定 菌體形態(tài)學及生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》[13]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]進行鑒定。無菌條件下將復篩所得純培養(yǎng)物接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落進行革蘭氏染色并且將純培養(yǎng)物接種于生化反應管中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察記錄結(jié)果。

1.2.6 菌株多重PCR 鑒定 參考Cao F M[15]種特異性引物（由重慶擎科興業(yè)生物技術有限公司合成，具體引物序列見表1）。多重PCR 反應體系為：引物BSL72、BSR328、L100、R836、L168、R514、R 674 各0.8 μL（0.5 μmol·L-1）、引物L354 為1.2 μL（0.5 μmol·L-1）、模 板DNA 1 μL（100 ng）、ddH2O 2.2 μL、2×Premix Taq 10 μL。反應程序：94℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，61.7 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[15]。將PCR 擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 種特異性引物Table 1 Species specific primers

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離純化與初篩結(jié)果

采用10 倍梯度稀釋法與平板劃線相結(jié)合，共分離純化得到57 株純培養(yǎng)物。通過點種于CMC 培養(yǎng)基培養(yǎng)，進行剛果紅染色、醋酸固定后測量水解圈直徑（D）與純培養(yǎng)物菌落直徑（d），共篩選出10株水解圈直徑與菌落直徑比值大于3 的菌株（表2）。水解圈直徑與菌落直徑的比值越大，表明菌株產(chǎn)纖維素酶能力越強，降解纖維素能力越強[16]。

表2 水解圈直徑與菌落直徑Table 2 Hydrolysis circle and colony diameter tests

2.2 菌株16S rRNA 基因鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

分別提取初篩所得10 株菌株DNA 進行16S rRNA基因PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得10 條約1 500 bp 目的條帶，與預期結(jié)果一致。將測序所得序列分別在NCBI 上進行BLAST 比對，結(jié)果顯示菌株LP5 與賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）16S rRNA 基因序列相似性最高，為99.86%，其屬于賴氨酸芽孢桿菌屬；其余9 株菌株與已知芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）16S rRNA 基因序列相似性均在98%以上，為芽孢桿菌屬，其中菌株X10 的16S rRNA 基因序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，MH934926.1）的相似性最高，相似性高達99.93%。

采用Neighbor-Joining（NJ）法，利用生物信息學軟件MEGA6.0 對10 株菌株16S rRNA 基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結(jié)果見圖1?；?6S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，菌株X10 與解淀粉芽孢桿菌（KF689544.1、JX907998.1、MH934926.1 等）位于同一簇內(nèi)，相似性最高。

圖1 基于16S rRNA 基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.3 初篩所得10 株菌株的復篩結(jié)果

將初篩得到的10 株菌株進行酶活測定，結(jié)果顯示，菌株X10 的CMC 酶活力最高，為31.9 U·mL-1（表3）。

2.4 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 形態(tài)學觀察及水解圈結(jié)果

高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 在普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)24 h 后，形成白色、凸起、表面褶皺無光澤、濕潤、黏稠、不透明、直徑3～4 mm 圓形的菌落（圖2）；革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，芽孢中生或端生、孢囊不膨大（圖3）；菌株X10 水解圈見圖4。

2.5 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 生化鑒定結(jié)果

高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 生化試驗結(jié)果由表4 可知，高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 七葉苷、VP 試驗、水楊酸試驗為陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、甘露醇、MR（甲基紅）、硫化氫、靛基質(zhì)試驗為陰性，符合解淀粉芽孢桿菌生理生化特性[13-14]。

表3 CMC 酶活測定結(jié)果Table 3 CMC enzyme activity assay results

圖2 菌株X10 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長特性Fig.2 Growth of strain X10 on general nutrient agar medium

圖3 菌株X10 革蘭氏染色（10×100 倍）Fig.3 Gram stained strain X10（10×100 times）

圖4 菌株X10 纖維素酶水解圈Fig.4 Cellulase hydrolysis circle by strain X10

2.6 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 多重PCR 擴增結(jié)果

提取菌株X10 基因組進行多重PCR 擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約736 bp 目的條帶，目的條帶基因片段大小與預期片段大小一致（圖5）。

表4 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 生化鑒定結(jié)果Table 4 Biochemical identification of cellulase-producing strain X10

圖5 高產(chǎn)纖維素酶菌株X10 多重PCR 擴增結(jié)果Fig.5 Multiplex PCR amplifications of cellulase-producing strain X10

3 討論

牛糞發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌株具有一定的地理氣候差異性。本研究從重慶三峽庫區(qū)3 個牛糞堆肥廠樣品中共分離得到57 株細菌，其中菌株X10 纖維素酶活最高，達31.9 U·mL-1。通過菌株形態(tài)特征觀察、生理生化試驗和16S rRNA 基因鑒定，確定菌株X10 為芽孢桿菌屬細菌，革蘭氏染色陽性。由于16S rRNA 基因鑒定方法只能確定到該菌所在的屬，無法精確到該菌的種。本研究利用Cao F M[15]學者于2008年建立的用于快速鑒定解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的多重PCR 方法對分離菌株X10 進行多重PCR 鑒定，最終確定菌株X10 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

纖維素酶是一種復合酶，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶能夠切割纖維素中β-1,4 糖苷鍵并且具有碳水化合物的結(jié)合位點，因此被認為是主要的纖維素酶[17]。近些年來對產(chǎn)纖維素酶微生物的研究報道越來越多。楊麗娜等[18]從腐爛秸稈和腐木分離篩選得到一株產(chǎn)耐熱性纖維素酶菌株NP29，其纖維素酶活為1.8 U·mL-1。姜軍坡等[19]以CMC 酶活力為指標，對解淀粉芽孢桿菌Tu-ll5 菌株產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，酶活力達到（18.43±0.91）U·mL-1，比優(yōu)化前提高了26.5 倍。黃玉蘭等[20]從若爾蓋高寒濕地土壤中篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株XW-1，CMC 酶活達到15.6 U·mL-1。王凱等[21]從140 株芽胞桿菌中篩選出一株具有較高纖維素酶活力的解淀粉芽胞桿菌FJAT-8 754，該菌株初始的纖維素酶活力為15.69 U·mL-1，經(jīng)均勻設計法優(yōu)化后纖維素酶活力高達202.9 U·mL-1。本研究通過水解圈法和CMC 酶糖化力法對分離菌株進行纖維素酶活性初篩和復篩，最終獲得一株CMC 酶活達31.9 U·mL-1的解淀粉芽孢桿菌X10，與上述學者分離所得的產(chǎn)纖維素酶菌株相比處于較高水平，其具有較好的產(chǎn)纖維素酶菌株初始條件，有望在纖維素酶活力優(yōu)化的進一步研究中發(fā)揮積極作用。

不同地理氣候特征和來源的產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌具有一定差異性。重慶三峽庫區(qū)屬亞熱帶濕潤季風氣候，并具有河谷氣候特點為夏季高溫、降水充沛，與長江以南同緯度或緯度偏低的臨近地區(qū)相比，具有明顯的熱量優(yōu)勢[22]。本研究從重慶三峽庫區(qū)3 個牛糞堆肥發(fā)酵場不同發(fā)酵時期的樣品中共分離得到57 株細菌，并篩選出1 株纖維素酶活力較高的解淀粉芽孢桿菌X10。解淀粉芽孢桿菌X10 在重慶三峽庫區(qū)高效降解纖維素菌劑的研發(fā)方面具有積極作用，同時有望為該地區(qū)牛糞的快速無害化降解提供優(yōu)勢菌種資源。