徐小艷 王建君 閆琛 李川 楊金花

鄭州人民醫(yī)院病理科（鄭州450000）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種特殊的臨床病理類型，約占浸潤性乳腺癌的20%，臨床上具有侵襲性強、預(yù)后差的特點，其對內(nèi)分泌和靶向治療均不敏感，缺乏有效的個體化治療方法［1-2］。三陰性乳腺癌預(yù)后相關(guān)分子指標成為研究的焦點。JMJD3 又稱賴氨酸去甲基化酶6B（lysine demethylase 6B，KDM6B），其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，被認為是具有潛在應(yīng)用價值的腫瘤評估指標之一。前期的研究結(jié)果表明JMJD3 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，其在正常組織中高表達，浸潤性癌組織中低表達，但并未進一步觀察JMJD3 在三陰性乳腺癌中的表達特點。10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）基因被認為是一種與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的抑癌基因，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。本研究旨在探討JMJD3 與PTEN在TNBC 中的表達及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并分析二者的相關(guān)性，為TNBC 靶向治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年1月至2015年12月在鄭州人民醫(yī)院乳腺外科行手術(shù)治療、術(shù)后經(jīng)病理確診且病歷完整的患者作為研究對象。研究樣本為87 例三陰性乳腺癌和80 例非三陰性乳腺癌病理活檢標，選取距三陰性乳腺癌腫物1 cm 處相對應(yīng)的癌旁組織作為對照。按照2012年WHO 乳腺癌組織病理分級分類法，對其進行分組。有完整5年隨訪資料的患者83 例，患者無病生存期從手術(shù)之日開始計算，終止日期為腫瘤復(fù)發(fā)日期或末次隨訪日。所有標本均經(jīng)10%的甲醛固定，石蠟包埋，并經(jīng)鄭州人民醫(yī)院病理科診斷確診。

1.2 主要試劑JMJD3 一抗兔抗人多克隆抗體公司購自Abcam，PTEN 一抗兔抗人單克隆抗體、二抗及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均為福州邁新公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色主要步驟如下：（1）石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；（2）抗原修復(fù)；（3）一抗37 ℃孵育2 h；（4）二抗37 ℃孵育20～30 min；（5）DAB 顯色5～10 min；（6）脫水、透明和封片。用已知JMJD3 和PTEN 陽性的乳腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽性和空白對照。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷根據(jù)染色強度和染色細胞所占百分比進行評分，半定量判定：低表達包括：（1）陰性即無陽性著色；（2）弱陽性（+或者++，細胞著色范圍＜30%）；高表達包括：（1）中等強度陽性（++，細胞著色范圍≥30%或者+++，細胞著色范圍＜50%）；（2）強陽性（+++，細胞著色范圍≥50%）。本研究中陽性表達率=高表達樣本量/總樣本含量，免疫組化的判讀有兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進行判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析JMJD3 和PTEN 陽性表達率和病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法，并以Log-rank 法檢驗。二者的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JMJD3和PTEN在癌旁組織、非三陰性乳腺癌、三陰性乳腺癌中的表達免疫組化顯示JMJD3 主要定位于細胞核，呈棕褐色，87 例三陰性乳腺癌JMJD3 的陽性表達率34.48%（30/87）明顯低于相對應(yīng)癌旁組織74.71%（65/87）和非三陰性乳腺癌組織75.00%（60/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=39.191，P＜0.001）。PTEN 主要定位于細胞漿，呈棕褐色，87 例三陰性乳腺癌中，PTEN 的陽性表達表達率40.23%（35/87）明顯低于相對應(yīng)癌旁組織68.97%（60/87）和非三陰性乳腺癌組織72.50%（58/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=22.329，P＜0.001）。JMJD3、PTEN 在非三陰性乳腺癌和癌旁組織中表達率基本相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1，表1。

表1 癌旁組織、非三陰性乳腺癌、三陰性乳腺癌中JMJD3和PTEN 的表達Tab.1 Expression of JMJD3，and PTEN in adjacent tissues，TNBC and non TNBC 例（%）

圖1 JMJD3 和PTEN 在癌旁組織、非三陰性乳腺癌、三陰性乳腺癌中的表達，免疫組織化學(xué)（物鏡200×）Fig.1 Expression of JMJD3 and PTEN in paracancerous tissue，non three negative breast cancer and three negative breast cancer，immunohistochemistry（objective 200×）

2.2 JMJD3 和PTEN 分別與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系87 例三陰性乳腺癌中，JMJD3 與組織學(xué)分級有關(guān)，即JMJD3 在高分化中的表達率76.00%（19/25）高于中-低分化17.74%（11/62），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=27.765，P＜0.001）；JMJD3 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中13.33%（6/45）低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57.14%（24/42），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.455，P＜0.001）；JMJD3 與TNM 分期有關(guān)，其在TNMⅠ期、Ⅱ期組別66.67%（20/30）高于Ⅲ期、Ⅳ期組別17.54%（10/57），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.994，P＜0.001）。JMJD3 與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置及腫瘤直徑均無關(guān)（均P＞0.05）。見表2。

87 例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，PTEN 在高分化中的表達率76.00%（19/25）高于中-低分化25.81%（16/62），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.667，P＜0.001）；其在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組別中22.22%（10/45）低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組別59.52%（25/42），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.571，P＜0.001）；其在TNMⅠ期、Ⅱ期組別70.00%（21/30）高于Ⅲ期、Ⅳ期組別24.56%（14/57），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.877，P＜0.001）。PTEN 與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置和腫瘤直徑均無關(guān)（均P＞0.05）。見表2。

表2 三陰性乳腺癌組織中JMJD3和PTEN的表達與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of JMJD3 and PTEN with clinicopathological characteristics of TNBC

2.3 三陰性乳腺癌中JMJD3和PTEN的相關(guān)性87例三陰性乳腺癌組織中，JMJD3和PTEN同時高表達者23例（26.44%），同時低表達者45例（51.72%），僅JMJD3 表達高表達者7 例（8.05%），僅PTEN 表達高表達者12 例（13.79%）。采用Spearman 相關(guān)分析，結(jié)果顯示JMJD3 和PTEN 表達呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（R=0.539，P＜0.001）。見表3。

表3 三陰性乳腺癌中JMJD3 和PTEN 的相關(guān)分析Tab.3 Spearman analysis of JMJD3 and PTEN in TNBC

2.4 JMJD3 和PTEN 蛋白表達與乳腺癌患者無病生存期的關(guān)系83 例三陰性乳腺癌患者5年總體無病生存率為49.0%（19/83）。JMJD3蛋白高表達者的無病生存率86.7%（26/30）高于低表達者43.4%（23/53），經(jīng)Log-rank 時序檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.832，P＜0.001）。PTEN 蛋白高表達者無病生存率82.9%（29/35）高于低表達者41.7%（20/48），經(jīng)Log-rank 時序檢驗，兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.783，P＜0.001）。JMJD3 和PTEN 共同高表達、單一指標高表達、二者均低表達無病生存率依次下降分別為87.5%（21/24）、75%（12/16）、37.2%（15/43），經(jīng)Log-rank 時序檢驗，三組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=28.933，P＜0.001）。見圖2。

3 討論

TNBC 是一組高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其組織學(xué)特點是腫瘤細胞核異型性明顯，核分裂象易見，分化較差，大部分組織學(xué)級別高，具有侵襲性強、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點，對內(nèi)分泌治療和靶向治療均不敏感，治療較其他類型的乳腺癌更為困難，僅有15%～20%的TNBC 患者對化療敏感［3］，5年生存率較低［4］。因此，TNBC 患者迫切需要新的治療方法來改善預(yù)后，對三陰性乳腺癌相關(guān)分子研究引起越來越多的重視。

圖2 JMJD3 和PTEN 蛋白的表達與三陰性乳腺癌患者無病生存期的關(guān)系Fig.2 Expression of JMJD3 and PTEN protein and disease-free survival of triple negative breast cancer patients

JMJD3 編碼基因位于人類第17 號染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3 作為一種賴氨酸27 位點三甲基化組蛋白H3 去甲基化酶（histone H3 methylated Lys27，H3K27me3），其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［5-6］，JMJD3 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演促癌基因或者抑癌基因角色，報道不一。國內(nèi)有研究表明［7］JMJD3 表達降低可能促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。在胃癌中JMJD3 低表達對胃癌細胞的增殖具有抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用［8］。上述研究均表明JMJD3 在腫瘤中扮演抑癌基因角色。但是，部分研究表明JMJD3 在腫瘤中扮演促癌基因角色，研究發(fā)現(xiàn)［9］膠質(zhì)母細胞瘤中JMJD3 表達高于正常腦組織，JMJD3 抑制劑能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，抑制細胞遷移。張陪陪［10］研究表明在肝癌細胞中轉(zhuǎn)染入JMJD3 的干擾質(zhì)粒后，肝癌細胞的生長、增殖、侵襲能力均降低。

有關(guān)JMJD3 在乳腺癌組織中表達規(guī)律的研究，前期研究［11］結(jié)果顯示JMJD3 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織表達水平較癌旁組織低，JMJD3 蛋白在組織學(xué)分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較高TNM 分期中表達率減低，JMJD3 在乳腺癌中扮演了抑癌基因的角色，其在三陰性乳腺癌表達減低，但是前期研究尚未進一步觀察JMJD3 在三陰性乳腺癌中表達與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。本研究結(jié)果表明JMJD3 在三陰性乳腺癌表達減低，其在乳腺癌旁組織和非三陰性乳腺癌中表達較高。JMJD3 在三陰性乳腺癌組織學(xué)分化差、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期表達減低，其表達越低，患者無病生存期越短。有研究表明JMJD3 家族去甲基化酶是通過參與性激素受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮其生理功能的，在女性乳腺癌細胞中JMJD3 表達明顯增加［12］，這也能夠解釋在三陰性乳腺癌中JMJD3 表達減低的原因。本研究結(jié)果顯示腫物直徑越大，JMJD3 表達率越低，但差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義，可能跟研究樣本量有關(guān)。

PTEN 是一種重要的抑癌基因，表達一種膜結(jié)合型脂質(zhì)磷酸酶，能催化三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化，進而拮抗PI3K，最終抑制細胞生長并介導(dǎo)細胞凋亡［13］。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在PTEN基因的突變，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［14-16］，它能夠負性調(diào)節(jié)細胞生長，誘導(dǎo)凋亡并抑制細胞浸潤和轉(zhuǎn)移［17-18］。本研究結(jié)果表明，三陰性乳腺癌組織中PTEN 蛋白的陽性表達率低于乳腺癌旁組織和非三陰性乳腺癌組織，其表達與乳腺癌的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和預(yù)后有關(guān)，而PTEN 蛋白的表達與其他臨床病理特征包括年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑均無關(guān)。以往文獻［19］報道，PTEN 蛋白在三陰性乳腺癌中低表達，其表達與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與組織學(xué)分級無關(guān)。筆者推測其原因如下：（1）跟樣本含量有關(guān)；（2）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀標準不同。孫志微等［20］研究表明PTEN 抑癌基因可通過抑制三陰性乳腺癌細胞FAK 磷酸化，抑制腫瘤細胞復(fù)制，進而抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲。PTEN 在三陰性乳腺癌中的具體作用機制尚需進一步研究。

本研究結(jié)果表明，JMJD3 和PTEN 在三陰性乳腺癌中表達均減低，扮演抑癌基因角色，二者均低表達患者預(yù)后更差，相關(guān)分析結(jié)果顯示二者呈明顯正相關(guān)關(guān)系，在三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能存在協(xié)同作用。有關(guān)二者的相關(guān)性，國內(nèi)外尚未見同類文獻報道。值得注意的是，有研究表明JMJD3 能夠通過NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進黑色素瘤的進展和轉(zhuǎn)移［21］，NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過miR-181a/PTEN 軸促進大腸癌細胞生長［22］，在結(jié)腸癌中PTEN 能夠通過PI3K/AKT/NF-kB 途徑抑制結(jié)腸癌的進展［23］。由此可見JMJD3 和PTEN涉及共同的信號通路，二者在三陰性乳腺癌中具體作用機制可以作為后續(xù)的進一步研究方向。

綜上所述，JMJD3 和PTEN 的異常表達與三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，二者可能存在相關(guān)調(diào)控機制，本研究不僅為相關(guān)信號通路機制研究提供依據(jù)，而且提示對三陰性乳腺癌JMJD3 和PTEN 的檢測有助于判斷疾病的進展和預(yù)后，為尋找三陰性乳腺癌治療靶標提供新的方向。