殷慧群 曹振毅 姜宏

1安徽省第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（合肥230041）；2第901 醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（合肥230032）

近年來，體外受精促排卵過程中hCG日孕酮（progesterone，P）水平升高對(duì)胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響逐漸引起大家關(guān)注。不論是自然周期，還是促排卵周期，血清P 水平升高并不是一起偶發(fā)事件，可占促排卵周期的13%～46%［1］；而且與促排卵方案無關(guān)［2］。有研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，hCG日血清P水平升高可引起胚胎-子宮內(nèi)膜不同步，導(dǎo)致胚胎植入失敗，與新鮮移植周期妊娠率降低有關(guān)。然而，血清P 水平對(duì)妊娠結(jié)局的影響仍然存在爭(zhēng)議，其主要原因在于P 水平升高閾值的界定不一致，變化范圍為0.4～3.0 ng/mL［5］。其次，P 水平升高對(duì)胚胎質(zhì)量是否存在不利影響，目前還沒有統(tǒng)一觀點(diǎn)［6-7］。HILL 等［5］利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法綜合臨床結(jié)局和花費(fèi)成本兩方面研究發(fā)現(xiàn)，hCG日血清P 閾值設(shè)定在1.5～2.0 ng/mL 時(shí)比較合適，高于此值，一小部分患者可能面臨新鮮移植失敗風(fēng)險(xiǎn)，如果實(shí)施全胚冷凍，將會(huì)是一種更具經(jīng)濟(jì)效益的選擇。此外，目前關(guān)于拮抗劑方案促排卵過程中血清P 水平對(duì)胚胎質(zhì)量和臨床妊娠結(jié)局影響的研究較少。因此，本研究擬設(shè)定hCG日血清P 閾值為1.5 ng/mL，比較拮抗劑方案中P＜1.5 ng/mL 新鮮移植周期與P≥1.5 ng/mL 全胚冷凍周期首次解凍移植后妊娠結(jié)局差異，以及獲卵數(shù)和胚胎質(zhì)量差異；其次，根據(jù)P 水平將P≥1.5 ng/mL 全胚冷凍周期組分成三個(gè)亞組，比較各組間妊娠結(jié)局、獲卵數(shù)和胚胎質(zhì)量差異；最后，當(dāng)1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 時(shí)，比較新鮮移植周期和全胚冷凍周期首次解凍后妊娠結(jié)局差異；旨在為臨床醫(yī)生選擇更具經(jīng)濟(jì)效益的移植時(shí)機(jī)提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2016年1月至2019年10月在第901 醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI 助孕的1 159 例患者資料。根據(jù)hCG日P 水平及是否新鮮周期移植將患者分為三組：A 組：hCG日P＜1.5 ng/mL 且新鮮周期移植，共897 周期。B 組：hCG日P≥1.5 ng/mL，行全胚冷凍，共199 周期。其中196周期行解凍周期移植；再根據(jù)P 水平，將其分為三個(gè)亞組：B1，1.5 ≤P＜2.0 ng/mL（37 周期）；B2，2.0 ≤P＜3.0 ng/mL（128 周期）；B3，P≥3.0 ng/mL（34 周期）。C 組：hCG日1.5 ≤P＜2.0 ng/mL，行新鮮周期移植，共63 周期。比較不同組間促排卵、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局。

患者納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）年齡＜38 歲；（2）促排卵方案為拮抗劑方案；（3）曾行IVF/ICSI 助孕次數(shù)＜3 次；（4）第3 天（D3）至少有一枚可利用胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）卵巢低反應(yīng)；（2）行補(bǔ)救ICSI 周期；（3）宮腔積液、子宮內(nèi)膜異位癥、縱隔子宮和雙子宮等；（4）患者夫婦染色體核型異常；（5）有輔助生殖禁忌證者。

1.2 方法

1.2.1 控制性促排卵采用靈活拮抗劑方案［8］，即從月經(jīng)周期第2～3 天給予促性腺激素（Gn）促排卵，4～5 d后根據(jù)卵泡大小及激素水平添加促性腺激素釋放激素拮抗劑（GnRH-A），當(dāng)3 個(gè)卵泡直徑≥17 mm 或2 個(gè)卵泡直徑≥18 mm 時(shí)，注射hCG 5 000 U，36 h 取卵。D3 或D5 行胚胎移植或冷凍，移植后常規(guī)黃體支持。

1.2.2 體外受精、胚胎培養(yǎng)、評(píng)分及冷凍取卵日超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道卵泡穿刺術(shù)，分揀出卵冠丘復(fù)合物，成熟培養(yǎng)3～4 h，根據(jù)優(yōu)化處理后精液參數(shù)行常規(guī)IVF 或ICSI 受精，然后常規(guī)序貫微滴培養(yǎng)。D1 觀察原核，見1～2 個(gè)原核或雙極體見卵裂者均視為正常受精，≥3 個(gè)原核視為多精受精。D3 卵裂速度正常，卵裂球大小較均勻，細(xì)胞數(shù)為7～10 且碎片＜25%的胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎。細(xì)胞數(shù)為≥6 且碎片＜50%的胚胎視為可利用胚胎。正常受精D3 細(xì)胞數(shù)≥4 且碎片＜50%胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第5～7 天。根據(jù)GARDNER［9］分級(jí)對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分，≥2 期囊胚納入形成囊胚數(shù)計(jì)算，≥3 期且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分不同時(shí)含C 級(jí)囊胚視為可利用囊胚。胚胎行玻璃化冷凍，囊胚冷凍前常規(guī)激光輔助皺縮。

1.2.3 解凍周期包括自然周期和激素替代周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。按照玻璃化解凍程序解凍胚胎，培養(yǎng)2 h 后移植，囊胚解凍后即刻激光輔助消除1/4周長(zhǎng)透明帶。

1.2.4 妊娠判斷胚胎移植后30～35 d B 超檢查見妊娠囊和原始心管搏動(dòng)診斷為臨床妊娠，持續(xù)妊娠至8 周及以上視為持續(xù)妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用ANOVA 單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P＜1.5 ng/mL新鮮移植周期與P≥1.5 ng/mL全胚冷凍周期患者基本特征及胚胎質(zhì)量比較由表1 可見，兩組間患者臨床基本特征相似。相對(duì)于P＜1.5 ng/mL 組（A 組），P≥1.5 ng/mL 組（B 組）平均Gn 用量及Gn 天數(shù)較多（P＜0.05），相應(yīng)地，平均獲卵數(shù)也較多（P＜0.05）。此外，卵裂率、D3優(yōu)胚率和囊胚形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明hCG日P 升高對(duì)胚胎質(zhì)量無明顯影響。

2.2 P＜1.5 ng/mL新鮮移植周期與P≥1.5 ng/mL全胚冷凍首次解凍周期臨床結(jié)局比較P≥1.5 ng/mL全胚冷凍組（B 組）首次解凍共196 個(gè)周期，與P＜1.5 ng/mL 新鮮移植組（A 組）比較，臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步按照移植胚胎發(fā)育時(shí)間比較，不論是卵裂胚移植還是囊胚移植，兩組間臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3 全胚冷凍組按P高低組內(nèi)比較促排卵、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局由表3 可見，1.5 ≤P＜2.0 ng/mL組（B1 組），2.0 ≤P＜3.0 ng/mL 組（B2 組）和P≥3.0 ng/mL 組（B3 組）平均Gn 用量及Gn 時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相對(duì)于B1 組，B2 組和B3組平均Gn 用量較多；相應(yīng)地，B2 組和B3 組平均獲卵數(shù)也較高（P＜0.05）。此外，三組間卵裂率、D3優(yōu)胚率及囊胚形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 P＜1.5 ng/mL 新鮮移植周期（A 組）與P≥1.5 ng/mL全胚冷凍周期（B 組）患者基本特征及胚胎質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of patients′basic characteristics and embryo quality between fresh transfer cycles with progesterone＜1.5 ng/mL（Group A）and“freeze all”cycles with progesterone≥1.5 ng/mL（Group B） ±s

表1 P＜1.5 ng/mL 新鮮移植周期（A 組）與P≥1.5 ng/mL全胚冷凍周期（B 組）患者基本特征及胚胎質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of patients′basic characteristics and embryo quality between fresh transfer cycles with progesterone＜1.5 ng/mL（Group A）and“freeze all”cycles with progesterone≥1.5 ng/mL（Group B） ±s

周期數(shù)女方年齡（歲）BMI（kg/m2）bFSH（IU/L）原發(fā)不孕比例（%）ICSI比例（%）平均Gn用量（IU）平均Gn時(shí)間（d）平均獲卵數(shù)MII卵率（%）受精率/獲卵數(shù)（%）多精受精率/獲卵數(shù)（%）卵裂率（%）D3優(yōu)胚率（%）囊胚形成率（%）優(yōu)質(zhì)囊胚率（%）A組897 29.87±3.96 23.46±3.64 8.78±3.53 47.05（422/897）18.84（169/897）1 835.79±656.17 8.55±1.89 11.36±4.92 83.96（8 544/10 188）72.06（7 341/10 188）4.53（462/10 188）98.23（7 211/7 341）52.28（3 770/7 211）55.15（2 441/4 426）34.33（838/2 441）B組199 29.49±4.23 23.63±4.04 8.54±3.46 44.72（89/199）22.11（44/199）1 952.00±708.98 9.15±1.98 14.41±7.06 80.54（2 289/2 842）68.44（1 945/2 842）4.82（137/2842）98.36（1 917/1 949）54.77（1 050/1 917）54.45（734/1 348）34.06（250/734）P值0.234 6 0.559 8 0.384 1 0.55 0.29 0.026 2＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.52 0.70 0.17 0.65 0.89

表2 P＜1.5 ng/mL 新鮮移植周期（A 組）與P≥1.5 ng/mL全胚冷凍組（B 組）首次解凍臨床結(jié)局比較Tab.2 Comparison of clinical outcomes between fresh transfer cycles with progesterone＜1.5 ng/mL（Group A）and the first FET cycles after“freeze all”cycles with progesterone≥1.5 ng/mL（Group B）

表3 全胚冷凍組按P 高低組內(nèi)比較促排卵、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局Tab.3 Comparison of ovarian stimulation，embryo quality and pregnancy outcomes among the cycles with“freeze all”strategy according to progesterone level ±s

表3 全胚冷凍組按P 高低組內(nèi)比較促排卵、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局Tab.3 Comparison of ovarian stimulation，embryo quality and pregnancy outcomes among the cycles with“freeze all”strategy according to progesterone level ±s

注：與B1 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B2 組比較，△△P＜0.01

周期數(shù)平均P 值（ng/mL）平均年齡（歲）平均Gn 用量（IU）平均Gn 時(shí)間（d）平均獲卵數(shù)MII 卵率（%）受精率/獲卵數(shù)（%）卵裂率（%）D3 優(yōu)胚率（%）囊胚形成率（%）優(yōu)質(zhì)囊胚率（%）移植周期數(shù)臨床妊娠率（%）卵裂胚種植率（%）囊胚種植率（%）持續(xù)妊娠率（%）B1 組（1.5 ≤P＜2.0 ng/mL）37 1.82±0.13 30.11±4.68 1 740.95±566.59 8.21±1.39 10.95±5.60 81.23（329/405）67.90（275/405）97.45（268/275）57.84（155/268）56.00（98/175）30.61（30/98）34 50（17/34）30.43（7/23）52.17（12/23）44.12（15/34）B2 組（2.0 ≤P＜3.0 ng/mL）128 2.36±0.25 29.02±3.94 1 964.24±760.89 9.30±2.07**14.99±6.89**80.98（1 554/1 919）69.36（1 331/1 919）98.42（1 310/1 331）55.04（721/1 310）54.11（507/937）33.14（168/507）128 59.38（76/128）41.03（32/78）55.00（55/100）50.78（65/128）B3 組（P≥3.0 ng/mL）34 5.38±5.12 30.59±4.61 2 189.71±550.11**9.74±1.80**15.24±7.68**△△78.38（406/518）66.22（343/518）98.83（339/343）51.33（174/339）54.66（129/236）40.31（52/129）34 47.06（16/34）14.81（5/27）52.17（12/23）38.24（13/34）P 值＜0.001 0.098 3 0.026 9 0.002＜0.001 0.24 0.37 0.39 0.26 0.90 0.23 0.34 0.07 0.95 0.39

2.4 1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 患者行新鮮周期移植和全胚冷凍后首次解凍周期移植促排卵、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較不論是平均Gn 用量和獲卵數(shù)，還是胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局，兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 hCG日1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 患者行新鮮周期移植（C 組）和解凍周期移植（B1 組）促排卵、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較Tab.4 Comparison of ovarian stimulation，embryo quality and pregnancy outcomes of the cycles with progesterone level varying from 1.5 to 2 ng/mL between fresh transfer（Group C）and the first FET after“freeze all”strategy（Group B1） ±s

表4 hCG日1.5 ≤P＜2.0 ng/mL 患者行新鮮周期移植（C 組）和解凍周期移植（B1 組）促排卵、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局比較Tab.4 Comparison of ovarian stimulation，embryo quality and pregnancy outcomes of the cycles with progesterone level varying from 1.5 to 2 ng/mL between fresh transfer（Group C）and the first FET after“freeze all”strategy（Group B1） ±s

周期數(shù)平均年齡（歲）平均P 值（ng/mL）平均Gn 用量（IU）平均Gn 時(shí)間（d）平均獲卵數(shù)MII 卵率（%）受精率/獲卵數(shù)（%）移植周期數(shù)臨床妊娠率（%）卵裂胚種植率（%）囊胚種植率（%）持續(xù)妊娠率（%）C 組63 29.24±3.94 1.77±0.15 1 847.61±690.59 8.85±1.86 12.43±5.28 81.86（641/783）70.24（550/783）63 53.97（34/63）41.84（41/98）46.67（7/15）46.03（29/63）B1 組37 30.11±4.68 1.82±0.13 1 740.95±566.59 8.21±1.39 10.95±5.60 81.23（329/405）67.90（275/405）34 50（17/34）30.43（7/23）52.17（12/23）44.12（15/34）P 值0.322 8 0.094 5 0.428 6 0.072 6 0.188 8 0.79 0.41 0.83 0.35＞0.99＞0.99

3 討論

3.1 hCG日血清P 升高對(duì)體外受精妊娠結(jié)局的影響及機(jī)制眾多研究和Meta分析結(jié)果提示，hCG日P 升高對(duì)IVF 新鮮周期臨床結(jié)局有不利影響［3，10］，高于一定的臨界值，建議全胚冷凍行解凍周期移植。本研究結(jié)果也表明，全胚冷凍后行解凍周期移植并不降低妊娠率，是一種可供選擇的移植策略。IVF 周期中hCG日P 升高引起的子宮內(nèi)膜變化，主要表現(xiàn)為：（1）子宮內(nèi)膜組織學(xué)進(jìn)展超過3 d；（2）胚胎種植相關(guān)蛋白如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和胎盤生長(zhǎng)因子（PIGF）異常表達(dá)；（3）與自然殺傷細(xì)胞（NK）活性相關(guān)的基因表達(dá)異常；（4）表觀遺傳圖譜的差異［11］。因此，hCG日P 升高，可導(dǎo)致胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，降低臨床妊娠率。但也有部分研究表明，對(duì)于高反應(yīng)患者，P 升高與妊娠結(jié)局沒有相關(guān)性［1］；或是P 升高的臨界值與患者卵巢反應(yīng)性有關(guān)，與低反應(yīng)和正常反應(yīng)患者相比，高反應(yīng)患者P 升高對(duì)臨床妊娠不利影響的臨界值也較高。例如，大樣本回顧性研究發(fā)現(xiàn)低反應(yīng)、正常反應(yīng)和高反應(yīng)患者h(yuǎn)CG日P 升高對(duì)妊娠不利影響的臨界值分別為1.5、1.75 和2.25 ng/mL［10］。本研究結(jié)果也提示，當(dāng)hCG日P 水平介于1.5～2.0 ng/mL 時(shí)，新鮮周期移植和解凍周期移植臨床妊娠結(jié)局無明顯差異，這可能與本研究對(duì)象排除低反應(yīng)患者有關(guān)。此外，也有研究［12-13］認(rèn)為hCG日P水平升高除了與促性腺激素總劑量、hCG日當(dāng)天的E2 水平以及募集的卵泡數(shù)有關(guān)之外，可能還與促排卵方案類型、給予促性腺激素類型有關(guān)。因此，在目前的臨床實(shí)踐中，很難將單一P 水平作為IVF 周期臨床妊娠的預(yù)測(cè)因子［14］。

3.2 hCG日血清P 升高對(duì)胚胎質(zhì)量的影響盡管大部分研究證實(shí)hCG日P 升高對(duì)子宮內(nèi)膜容受性有不利影響，而關(guān)于P 升高是否影響胚胎質(zhì)量，目前還沒有統(tǒng)一觀點(diǎn)，有研究［6］認(rèn)為hCG日P 升高可降低卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，降低優(yōu)質(zhì)胚胎率，可利用胚胎率和累積活產(chǎn)率［15］；或是降低可利用胚胎率，但對(duì)全胚冷凍后續(xù)累積活產(chǎn)率無明顯影響［16］。本研究結(jié)果提示hCG日P 升高并不影響胚胎質(zhì)量，此結(jié)果與某些研究相似［17-18］。

3.3 hCG日血清P 升高與促排卵的關(guān)系本研究結(jié)果還提示，hCG日P 升高與給予的促性腺激素的總量和獲卵數(shù)有關(guān)，高反應(yīng)患者卵巢對(duì)促排卵刺激更易于在hCG日出現(xiàn)高孕酮。關(guān)于刺激周期中卵泡晚期P 升高的確切機(jī)制并不是很清楚。近年來研究表明，為獲得多個(gè)卵泡的生長(zhǎng)，相對(duì)高劑量外源性FSH 的給予，可導(dǎo)致hCG日P 的升高；hCG日P 水平與獲卵數(shù)呈正相關(guān)，P 的升高可能是多個(gè)卵泡發(fā)育至成熟卵泡前激素分泌累積造成的［19-21］。最近一項(xiàng)體外試驗(yàn)研究表明，F(xiàn)SH 可刺激體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞中3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）的表達(dá)并增加其酶促活性，從而將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮，促進(jìn)顆粒細(xì)胞中P 的合成和輸出，而無需黃素化［22］。因此，在IVF 刺激周期中，如果較高水平的FSH 持續(xù)刺激卵巢，類固醇前體的生成量可能超過卵巢有效將其轉(zhuǎn)化為雌激素路徑的能力，有可能導(dǎo)致孕激素在卵泡膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化為雄激素延遲，從而導(dǎo)致孕激素累積和滲漏到體循環(huán)中，導(dǎo)致血清中P 水平升高。

本研究為回顧性分析，部分組樣本量較少，存在一定的局限性。將來可擴(kuò)大樣本量，根據(jù)患者卵巢反應(yīng)性，進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)一步評(píng)估hCG日血清孕酮升高對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

綜上所述，hCG日P 升高與促性腺激素總量和獲卵數(shù)有關(guān)，對(duì)胚胎質(zhì)量無明顯影響，全胚冷凍后解凍周期移植不降低臨床妊娠率。hCG日P 在1.5～2.0 ng/mL 時(shí)，新鮮周期移植和解凍周期移植妊娠結(jié)局相似，因此，對(duì)是否全胚冷凍需進(jìn)行個(gè)體化處理，以便患者在IVF 助孕中有更多獲益。