饒金蘭 朱艷 何佩耕 黎偉 黃莉 薛超

1廣西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（南寧530021）；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科（南寧530007）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody，ANCA）相關(guān)性血管炎（ANCAassociated vasculitis，AAV）是一種嚴(yán)重的自身免疫性疾病，可引起全身系統(tǒng)性小血管炎癥，常累及腎臟、肺臟和皮膚，甚至可威脅生命。目前，盡管AAV 的確切發(fā)病機制及病因未完全明確，但家族性病例報道及全基因組關(guān)聯(lián)研究均提示，AAV 具有遺傳傾向［1-2］。

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和存活的關(guān)鍵，近年來，越來越多的證據(jù)提示，AAV 患者與自噬障礙密切相關(guān)。TANG 等［3］研究顯示，自噬相關(guān)信號參與ANCA 新亞型抗溶酶體膜蛋白-2（LAMP-2）抗體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成和釋放機制，并且NETs 的形成可被自噬抑制劑顯著抑制。SHA 等［4］報道，經(jīng)ANCA 陽性IgG 處理的中性粒細(xì)胞可誘導(dǎo)出更高的自噬水平，自噬誘導(dǎo)物可促進(jìn)ANCA誘導(dǎo)的NETs的釋放，反之則抑制NETs 的釋放。ULK1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可與Atg13、Atg101 和黏著斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）共同組成自噬起始復(fù)合物。ULK1 復(fù)合物連接上游能量感應(yīng)激酶與下游自噬核心機制的中心節(jié)點，介導(dǎo)自噬體的形成和成熟過程，啟動了自噬的發(fā)生［5］。ULK1 作為該復(fù)合物最核心的組成部分，在激活自噬過程中起著關(guān)鍵性的作用。同時，ULK1 也被視為一個抑制自噬途徑的有效靶點［6］。近年來，ULK1 基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被證實與克羅恩病、強直性脊柱炎等自身免疫性疾病及結(jié)核桿菌感染等感染性疾病的易感性存在關(guān)聯(lián)［7-9］。由此可推測ULK1基因多態(tài)性與AAV 的易感性存在一定聯(lián)系。然而，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究，因此，本研究采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合高通量測序法對ULK1 基因的rs9652059、rs7953348、rs7488085 三個位點進(jìn)行基因分型，從而分析ULK1基因的單核苷酸多態(tài)性與廣西人群AAV 的易感性之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究所納入的研究對象病例組為2005年1月至2019年1月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院確診為AAV 的門診及住院的患者，共177 例，其中男68 例，女109 例。平均年齡為（53.85±15.04）歲。其診斷標(biāo)準(zhǔn)均嚴(yán)格參照2012年Chapel-Hill 國際血管炎命名會議標(biāo)準(zhǔn)［10］，同時排除繼發(fā)性血管炎，如繼發(fā)感染、藥物、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。對照組為210例，其中男90例，女120 例，平均年齡為（51.31±12.78）歲。AAV 組與對照組的年齡及性別差異均沒有無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具備可比性。所有研究對象及其直系三代親屬均為廣西人群，且均簽署書面知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查后獲批（2018 第KY-0100 號）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料的收集收集患者確診時的臨床資料及腎臟病理結(jié)果。臨床資料包括患者的籍貫、性別、年齡、血壓及起病時的發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、咳嗽等臨床癥狀；以及實驗室檢查資料如中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、C 反應(yīng)蛋白、血清尿素氮、肌酐、尿酸、白蛋白等。

1.2.2 外周血基因組DNA提取和保存用EDTA 抗凝采血管采集所有研究對象的外周靜脈血各2 mL，并用由天根生化科技（北京）有限公司提供DNA提取試劑盒提取DNA，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將吸光度（A）值（A260/280 nm）在1.5～2.0，濃度＞50 ng/μL 的DNA 樣品，置于-20 ℃冰箱保存用于后續(xù)實驗。

1.2.3 SNP位點選取從1 000 genome（http：//grch37.ensembl.org/）下載ULK1 基因的位點信息，隨后通過Haploview 4.2 軟件進(jìn)行SNP 的篩選，選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）最小等位基因頻率（MAF）≥0.05；（2）Hangy-Weinberg 平衡（HWE）檢測P＞0.05。同時結(jié)合美國國家生物信息中心（NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）查詢到SNP 的位置、MAF 等相關(guān)信息及既往研究中ULK1基因多態(tài)性位點與免疫性、炎癥性疾病相關(guān)的位點中選取3個SNP位點［8，11］。

1.2.4 SNP 位點基因分型本研究采用多重PCR結(jié)合高通量測序技術(shù)（上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行SNP 位點基因型檢測。引物序列如表1所示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。近似正態(tài)分布的計量資料的統(tǒng)計描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距；計數(shù)資料以計數(shù)或百分比表示?；蛐图暗任换蝾l率分布通過卡方檢驗或Fisher′s 確切概率法。臨床特征中近似正態(tài)分布的計量資料的對比通過獨立樣本t檢驗或方差分析，偏態(tài)資料、等級資料則進(jìn)行秩和檢驗。采用SNPStats 軟件計算OR值與95%CI來評估5 種遺傳模型下基因型與疾病風(fēng)險的關(guān)系［12］。通過SHEsis軟件分析Hangy-Weinberg 平衡、SNP 位點間連鎖不平衡（LD）的分布規(guī)律及單體型頻率。以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 ULK1 基因SNP 位點rs9652059、rs7953348、rs7488085 的引物序列Tab.1 Primer sequences of SNPs rs9652059，rs7953348 and rs7488085 in ULK1

2 結(jié)果

2.1 等位基因頻率、基因型分布及HWE 分析在本研究中387 個樣本均基因分型成功（100%）。如表2所示，AAV 組與對照組均符合HWE 平衡，提示研究對象具有人群代表性。rs9652059 中的等位基因C 和rs7953348 中的等位基因T 與AAV 風(fēng)險增加相關(guān)（P=0.028，OR=1.412，95%CI：1.038～1.919）。rs7488085 的等位基因頻率在AAV 組和對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而3 個SNP 位點的基因型在兩組間的分布均無差異。

表2 ULK1 基因的SNP 位點在AAV 組及對照組中等位基因及基因型分布Tab.2 Distribution of allele and genotype of SNP in ULK1 gene in the AAV group and the control group 例（%）

2.2 遺傳模型及臨床資料分析如表3所示，在顯性模型和對數(shù)加性模型中，ULK1 的rs9652059 和rs7953348 位點的基因型分布在AAV 組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。在經(jīng)過年齡和性別調(diào)整之后，在顯性模型中，AAV 組rs9652059位點中攜帶TC+CC 基因型者增加了AAV 患病風(fēng)險（OR=1.66，95%CI：1.07～2.56，P=0.022）。rs7953348亦有相同結(jié)果。rs7488085 位點的基因型分布在5種遺傳模型中均與AAV 的發(fā)病不相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 顯性模型及隱形模型的臨床資料分析隱性模型中TT+TC（rs9652059）、CC+CT（rs7953348）具有相對更高的中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量及C 反應(yīng)蛋白水平（P=0.031、0.004、0.007、0.008），血尿素氮、肌酐、尿酸、白蛋白、血沉在兩組間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而在顯性模型中，臨床資料在這兩個位點的基因型分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。

2.4 連鎖不平衡及單體型分析將上述三個位點的基因型分布導(dǎo)入SHEsis在線軟件中分析，結(jié)果顯示，ULK1 基因的rs9652059-rs7953348 為完全連鎖不平衡。但rs9652059-rs7488085、rs7953348-rs7488085間不存在連鎖不平衡。三位點間所構(gòu)建的單體型中最常見的為TCT、CTT。以TCT 為參照，單體型CTT增加了AAV的發(fā)病風(fēng)險（OR=1.42，95%CI：1.02～1.98，P=0.039）。見表5。

3 討論

AAV 是一種快速進(jìn)展的嚴(yán)重的自身免疫性疾病。盡管近年來隨著免疫抑制劑等治療的發(fā)展，AAV 的五年生存率已顯著提高，但相較年齡、性別匹配的普通人，AAV 患者病死率仍高達(dá)2.6 倍［13］，同時激素及免疫抑制劑的毒副作用，如心血管疾病、感染、血栓等嚴(yán)重威脅AAV 患者的生命健康及極大降低生存質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)rs9652059等位基因C和rs7953348等位基因T 為AAV 的風(fēng)險等位基因。在經(jīng)過年齡和性別調(diào)整之后，攜帶TC+CC（rs9652059）和CT+TT（rs7953348）者顯著增加發(fā)病風(fēng)險。然而，ULK1基因突變?nèi)绾斡绊慉AV 發(fā)病目前尚不清楚。近來多項研究揭示了，ANCA過度激活中性粒細(xì)胞引起大量的NETs 形成、釋放及無序降解在AAV 的發(fā)

病機制中發(fā)揮著重要的作用［14-15］。自噬參與調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞脫顆粒及NETs 的形成和釋放［16］，這在AAV 中ANCA 刺激中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的NETs 形成中也得到了證實［3-4］。ULK1 復(fù)合物是啟動自噬過程的關(guān)鍵節(jié)點，可通過磷酸化beclin-1 等下游底物，募集其他自噬相關(guān)蛋白至吞噬體，促進(jìn)自噬體的形成，從而啟動自噬［17］?；诖?，我們推測ULK1 rs9652059 等位基因C 和rs7953348 等位基因T 可通過導(dǎo)致自噬功能的紊亂引起NETs 的釋放與降解失調(diào)，從而與AAV 存在密切聯(lián)系。

表3 在不同遺傳模型下ULK1 的SNP 位點與發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性分析（經(jīng)調(diào)整性別、年齡后）Tab.3 Genotypic model analysis of the relationship between SNPs rs9652059，rs7953348 and rs7488085 in ULK1 and the risk of AAV（after adjustment for gender and age）

表4 ULK1rs9652059 和rs7953348 在顯性模型與隱性模型中的臨床資料分析Tab.4 Analysis of SNPs rs9652059 and rs7953348 in ULK1 with clinical data M（P25，P75）

表5 SNP 位點構(gòu)建的單體型與AAV 發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系（經(jīng)調(diào)整性別、年齡后）Tab.5 Association analysis of haplotypes derived from SNPs in ULK1 and AAV risk（after adjustment for gender and age）

ULK1 是一種細(xì)胞質(zhì)激酶，是酵母自噬相關(guān)蛋白Atg1 在哺乳動物的同源蛋白。ULK1 蛋白在大部分組織中廣泛表達(dá)，其主要生物學(xué)功能是啟動細(xì)胞自噬，還可參與調(diào)控腫瘤、神經(jīng)退行性病變以及感染性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展［18］。CHEN 等［19］研究表明，ULK1 在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中的過表達(dá)，靶向shRNA 敲低ULK1 可抑制胃癌細(xì)胞的存活和增殖。一項日本在帕金森病患者及老年對照組間的全轉(zhuǎn)錄組分析報道，在帕金森病患者的外周血單核細(xì)胞（PMBCs）中，ULK1 的蛋白表達(dá)水平與正常人相比顯著升高［20］。ULK1缺陷型單核細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌復(fù)制增加，TNF分泌減少，自噬水平顯著降低［9］。迄今為止，國內(nèi)外尚未有關(guān)于ULK1基因多態(tài)性與AAV 易感性的相關(guān)研究，但其在其他疾病的研究正在被廣泛開展。在加拿大的一項哮喘的家系研究［21］發(fā)現(xiàn)，ULK1 rs9652959 位點的等位基因C 被過度傳遞給哮喘后代（P=0.0126），其等位基因頻率為0.85，提示等位基因C 在該項哮喘家系研究中為主要等位基因，控制哮喘性狀在家系中傳遞。ZHANG 等［8］發(fā)現(xiàn)ULK1 rs9652059（C→T）的突變可以增加中國漢族人群強直性脊柱炎的易感性，以SNP rs9652059 為中心的單體型在病例組和對照組間的分布差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。這與本研究中rs9652959 位點的主要等位基因在AAV 組及對照組中均為T，而風(fēng)險等位基因為C 相反。這提示了ULK1 介導(dǎo)的自噬途徑參與不同疾病的發(fā)病時所產(chǎn)生的效應(yīng)不同，還可能存在其他區(qū)別于自噬的生理病理作用。此外，ULK1 基因的SNP rs7953348 與應(yīng)用鉑類化療治療非小細(xì)胞肺癌患者的臨床獲益和總生存相關(guān)［22］。在新西蘭人群中發(fā)現(xiàn)SNP rs7488085，而不是rs7953348 與克羅恩病相關(guān)［11］。然而，在SNP rs7488085 與韓國兒童早發(fā)性克羅恩病的相關(guān)性研究中也未見陽性結(jié) 果［23］。在本研究中，SNP rs7953348 與AAV 的易感性相關(guān)，而rs7488085 的等位基因及基因型分布在AAV 組與健康對照組間均無差異。ULK1基因的SNP rs9652059位點等位基因C和rs7953348等位基因T 可能引起ULK1 的結(jié)構(gòu)差異，影響ULK1 的激酶活性，導(dǎo)致磷酸化ULK1 的難易程度產(chǎn)生差異，從而改變自噬的啟動，影響AAV 的易感性及預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量及CRP 水平在基因型的分布中存在差異。AAV 患者在活動期常發(fā)生貧血，多為腎性貧血［24］。由于網(wǎng)狀紅細(xì)胞的成熟過程，其中可能涉及到ULK1 介導(dǎo)的線粒體自噬［25］，ULK1 的多態(tài)性也可能導(dǎo)致紅細(xì)胞計數(shù)及血紅蛋白含量下降，可能進(jìn)一步加重貧血癥狀。非特異性炎癥標(biāo)志物CRP 在炎癥的活動期升高，并在穩(wěn)定期顯著下降［26］。中性粒細(xì)胞在AAV 的發(fā)病中為中心環(huán)節(jié)，因此中性粒細(xì)胞計數(shù)等相關(guān)指標(biāo)也可能因中性粒細(xì)胞的過度激活而產(chǎn)生變化。研究［27］表明，在兒童PR-3 ANCA 相關(guān)性血管炎中，中性粒細(xì)胞計數(shù)與疾病活動性密切相關(guān)。有趣的是，在本研究中，臨床資料的差異性分布是在隱性模型中觀察到，而不是與AAV 易感性相關(guān)的顯性模型。筆者認(rèn)為，風(fēng)險等位基因T（rs9652059）/C（rs7953348）與AAV 易感性之間可能存在更密切的相關(guān)性，而保護(hù)性等位基因C（rs9652059）/T（rs7953348）在發(fā)病后誘導(dǎo)一系列應(yīng)激反應(yīng)來對抗疾病的發(fā)展。本研究仍存在一定的局限性，樣本量相對較小且未進(jìn)行ULK1 及其相關(guān)自噬蛋白的功能性研究。接下來應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行ULK1 與AAV 發(fā)病的生物機制研究，為闡明AAV的分子遺傳學(xué)機制和ULK1 基因分子靶向治療提供依據(jù)。

綜上，ULK1 基因rs9652059、rs7953348 位點的多態(tài)性可能與廣西人群AAV 的易感性相關(guān)，且與中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量及CRP 水平相關(guān)，ULK1 所介導(dǎo)的自噬可能參與廣西人群AAV 的發(fā)病。