胡振，張瑾，賈偉

（合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

近年來(lái)，人類不斷發(fā)現(xiàn)各種各樣的新能源[1]，隨著研究的不斷深入，這些新能源的優(yōu)缺點(diǎn)也逐漸被人們所了解。其中，微藻作為光合微生物，具有生產(chǎn)周期短、生長(zhǎng)繁殖快、可吸收水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行新陳代謝并進(jìn)行光合作用產(chǎn)出油脂等特點(diǎn)，在廢水的處理和生物燃料的制備中被廣泛研究應(yīng)用。在這些研究中，微藻的捕獲是制作生物燃料的的關(guān)鍵步驟，但由于其細(xì)胞的尺寸較小，且細(xì)胞因表面帶負(fù)電而互相排斥[2]，從而使微藻回收成本過(guò)高，成為目前研究中的難點(diǎn)。本研究以小球衣藻為實(shí)驗(yàn)藻種，研究在不同營(yíng)養(yǎng)條件和附著材料下，小球衣藻的附著行為，同時(shí)進(jìn)行附著材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸附量的測(cè)定和微藻胞外聚合物分泌量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硝酸鈉，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥；氫氧化鈉、鹽酸、氨基磺酸、硫酸、蒽酮，均為分析純，國(guó)藥；Lorry低蛋白試劑，上海荔達(dá)。

Centrifuge5804高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；UV2600紫外分光光度計(jì)，上海Unico；BDP-250 CO2二氧化碳人工氣候箱，上海百典；KQ5200DE超聲波清洗器，江蘇昆山舒美；IX73+DP倒置顯微鏡，日本Olympus；LX-650-L高壓滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球衣藻懸液加入離心管中，在2 000 g條件下離心10 min，棄去上清液，進(jìn)行重懸，并再次離心；重復(fù)2次去除藻液中含有的亞硒酸鹽富集培養(yǎng)基（SE培養(yǎng)基），即得到實(shí)驗(yàn)用小球衣藻懸液，在無(wú)菌環(huán)境下密封備用。

配置5瓶硝態(tài)氮溶液，溶液中硝態(tài)氮濃度分別為SE培養(yǎng)基中硝態(tài)氮濃度的1、1/2、1/10、1/50、1/100，同時(shí)設(shè)置濃度為0的溶液作為對(duì)照。放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃條件下滅菌15 min后，加入試劑瓶中，每個(gè)濃度配置2瓶（A瓶、B瓶），將準(zhǔn)備好的藻溶液加入各個(gè)試劑瓶中，并在試劑瓶中分別加入2 cm×2 cm的親水性碳紙（Ⅰ瓶）或疏水性碳紙（Ⅱ瓶），1 h和8 h后取樣分析藻類密度，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行樣，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)在二氧化碳人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，實(shí)驗(yàn)中持續(xù)光照。

1.2.1 分光光度法測(cè)定藻類密度

小球衣藻在680 nm波長(zhǎng)處的吸收峰較高，用紫外分光光度計(jì)在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度并從校準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的藻類密度，即為水樣測(cè)定結(jié)果（cells/mL）；水樣若經(jīng)稀釋后測(cè)定，則結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)速度的測(cè)定

取30 μL藻液放在載玻片上使用倒置顯微鏡進(jìn)行顯微視頻拍攝，并將其連接到計(jì)算機(jī)，使用cellSens Standard軟件記錄運(yùn)動(dòng)視頻。每一組樣品拍攝一段視頻，使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞追蹤，將視頻用連續(xù)截屏功能按照500 ms/張的頻率進(jìn)行截取，用Image J手動(dòng)追蹤藻細(xì)胞并進(jìn)行位置標(biāo)識(shí)，以計(jì)算其運(yùn)動(dòng)速度。每個(gè)視頻中選取5個(gè)微藻的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析，每個(gè)微藻統(tǒng)計(jì)其20 s左右的平均運(yùn)動(dòng)速度。將小球衣藻在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)速度結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和歸納，并繪制出頻率分布圖和正態(tài)分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)微藻附著的影響

分別在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到1 h和8 h時(shí)，對(duì)碳紙上小球衣藻的附著量和溶液中小球衣藻的懸浮量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示。對(duì)溶液中的小球衣藻進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，如圖1A、1B所示，發(fā)現(xiàn)在各營(yíng)養(yǎng)條件和附著材料下，溶液中懸浮的小球衣藻相差不大。從圖1C、1D可以看出，在1 h時(shí)，相同附著材料中，小球衣藻的附著量較接近；在8 h時(shí)，隨著溶液中硝態(tài)氮濃度的增加，小球衣藻的附著量出現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，并在營(yíng)養(yǎng)限制性條件下（硝態(tài)氮濃度為1/10 SE）達(dá)到峰值，為（16.07±0.42）×104cells/cm2和（4.00±0.21）×104cells/cm2；且附著材料為親水性碳紙時(shí)小球衣藻的附著量明顯高于附著材料為疏水性碳紙時(shí)，最高附著量可達(dá)到其4倍左右。

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)濃度下小球衣藻的懸浮量和附著量

圖2 不同營(yíng)養(yǎng)濃度影響下小球衣藻的運(yùn)動(dòng)速度

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度對(duì)小球衣藻的附著有一定影響，尤其在硝態(tài)氮濃度為1/10 SE時(shí)促進(jìn)作用較明顯，且隨著時(shí)間增加影響逐漸加大；附著材料對(duì)微藻的附著也有著顯著影響。

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)下小球衣藻的運(yùn)動(dòng)速度

研究表明，微藻的運(yùn)動(dòng)速度也是影響其附著的重要指標(biāo)之一，所以研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度對(duì)微藻運(yùn)動(dòng)速度的影響是很必要的。統(tǒng)計(jì)1 h和8 h時(shí)微藻的運(yùn)動(dòng)速度，并對(duì)其頻率進(jìn)行正態(tài)分布的非線性擬合，擬合結(jié)果如圖2A、2C所示，將擬合后曲線中的速度期望進(jìn)行整合，得到圖2B、2D的期望值。從圖中可以看出隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的上升，小球衣藻的運(yùn)動(dòng)速度表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，并在1/10 SE培養(yǎng)基的硝態(tài)氮濃度下，運(yùn)動(dòng)速度出現(xiàn)峰值點(diǎn)，分別達(dá)到（26.60±0.69）μm/s、（25.21±0.89）μm/s，這種規(guī)律與微藻的附著結(jié)果類似，說(shuō)明限制性營(yíng)養(yǎng)濃度對(duì)小球衣藻的運(yùn)動(dòng)速度有促進(jìn)作用；隨著運(yùn)動(dòng)速度的增加，微藻與碳紙的碰撞概率上升，進(jìn)而促進(jìn)了小球衣藻的附著

3 結(jié)論

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和附著材料對(duì)小球衣藻的附著都有一定的影響，在硝態(tài)氮濃度為1/10 SE時(shí)，小球衣藻的附著達(dá)到峰值；限制性營(yíng)養(yǎng)濃度對(duì)小球衣藻的運(yùn)動(dòng)速度有促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)小球衣藻的附著。