席一梅 殷 亮 遲占有 李 欣 羅光宏

1（河西學院 甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心 張掖734000）

2（大連理工大學生物工程學院 大連116024）

3（中國科學院近代物理研究所 蘭州730000）

重離子束與傳統(tǒng)的輻照（如X 射線和γ 射線）相比，具有更高的傳能線密度（LET）和相對生物效應(yīng)（RBE）優(yōu)勢［1-2］。在分子水平上，重離子束輻照可更有效地導致DNA 雙鏈的斷裂、大量缺失和插入以及染色體重排［3-4］。重離子輻照突變可獲得更高突變率和更廣泛的突變類型，目前已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學及植物的品種改良［5-7］。重離子輻照對生物體的誘變機理的研究對進一步科學合理地應(yīng)用這項技術(shù)具有重要的價值，但其研究相對滯后。

微藻是地球上廣泛分布的光能自養(yǎng)型微生物，其獨特的光合系統(tǒng)和清晰的遺傳背景使其成為理想的新一代微生物細胞工廠。鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）是一種單細胞的嗜鹽經(jīng)濟綠藻，種類繁多，分布于海洋和高鹽環(huán)境中，是β-胡蘿卜素的最佳天然生物來源［8］。然而，在正常培養(yǎng)條件下，鹽生杜氏藻光合效率和β-胡蘿卜素產(chǎn)量較低，嚴重制約了其大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，如何高效提升鹽生杜氏藻的光合效率和β-胡蘿卜素的產(chǎn)量極具研究和應(yīng)用價值［9］。近年來，重離子束輻照技術(shù)在微藻品質(zhì)改良研究中得到了初步的應(yīng)用。Taleb 等［10］使用氬離子對單細胞小球藻（Chlorella vulgaris）進行輻照處理，經(jīng)過多次篩選得到脂質(zhì)含量比野生型顯著提升的突變株。Hu 等［11］通過重離子對沙漠鏈帶藻（Desmodesmus sp. S1）進行輻照誘變，獲得了油脂含量提高20.6%的突變藻株D90G-19，而他們通過同樣策略篩選獲得的一株微擬球藻突變株HP-1（Nannochloropsis oceanica HP-1），其生物量和油脂含量分別提高了19%和28%［11］，同時，篩選出的突變株的D90G-19 和HP-1 光合效率均高于野生株。上述研究表明：重離子輻照對藻類的光合系統(tǒng)具有顯著影響，但吸收劑量及時間對光合系統(tǒng)的損傷及修復機制的研究尚不清晰，迄今為止，重離子對微藻細胞光合系統(tǒng)的誘變靶點、以及微藻細胞對輻照誘變的響應(yīng)機制研究只有很少的報道。例如，在藍藻中，光系統(tǒng)II（PSII）被證明是γ 輻射對光合復合物精細結(jié)構(gòu)的特定目標［12］。Angelini 等［13］報道了離子輻射會損害植物光系統(tǒng)并減少光合作用的氧氣釋放；de Micco 等［14］研究表明，離子輻射會影響光合生物光合系統(tǒng)的相關(guān)蛋白元件，比如捕光天線復合物、電子傳遞載體以及碳固定中的酶。鹽生杜氏藻是極具應(yīng)用價值的經(jīng)濟藻種，也是重要的研究逆境生理適應(yīng)機制的模式綠藻［9］，但重離子束對鹽生杜氏藻的輻照研究在國內(nèi)外尚未見報道?；谏鲜鲈?，我們擬選擇重離子束對鹽生杜氏藻進行輻照處理，以期探究重離子輻照對綠藻的生物學效應(yīng)以及綠藻細胞對輻照損傷的光合響應(yīng)機制。

本研究利用中國科學院近代物理研究所重離子加速器（HIRFL）產(chǎn)生的重離子對對數(shù)生長期的鹽生杜氏藻細胞進行輻照處理，系統(tǒng)探究了重離子輻照對藻細胞的時間和劑量效應(yīng)，并對藻細胞的光合效率相關(guān)指標（光化學效率（Fv/Fm）、實際光合效率（ΦPSII）、熱耗散能力（NPQ）以及代謝產(chǎn)物β-胡蘿卜素的積累等）進行了測定，為進一步了解重離子輻照對鹽生杜氏藻光合系統(tǒng)的誘變機理提供了初步的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)基

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina CCAP 19/18）購于英國Culture Collection of Algae and Protozoa（Windermere， United Kingdom）公司，藻種在優(yōu)化的人工海水（ASW）培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強度約為50 μmol/(m2·s)，光暗周期為12 h∶12 h 每天定期手動搖3～4次并變換位置。

ASW培養(yǎng)基成份：NaCl 87.75 g/L，KNO30.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.08 g/L，CaCl20.111 g/L，MgCl2·6H2O 0.507 g/L，MgSO4·7H2O 0.123 g/L，微量元素A51 mL/L，調(diào)節(jié)pH=7.5。

A5成份：50 mmol/LH3BO3，10 mmol/L MnCl2·4H2O， 0.8 mmol/L ZnSO4·7H2O， 1.0 mmol/L CuSO4·5H2O，2 mmol/L NaMoO4·2H2O，1.5 mmol/L NaVO3，0.8 mmol/L CoCl2·6H2O，加入40 mmol/L Tris-buffer，調(diào)節(jié)pH=7.5。

1.2 重離子輻照

取一定量對數(shù)期藻液離心（4 500 r/min，20 min）收集，棄上清液，收集沉淀藻體，將濃縮藻液用ASW 培養(yǎng)基洗滌3 次，最終濃縮藻液體積為1 mL，并轉(zhuǎn)入輻照小皿中，用封口膜密封后進行重離子輻照。實驗采用的重離子束能量為80 MeV/u，LET 為33 keV/μm，劑量率為20 Gy/min，吸收劑量分別為0 Gy、30 Gy、60 Gy、90 Gy、120 Gy、180 Gy、240 Gy、320 Gy。輻照后收集藻液，然后轉(zhuǎn)入裝有培養(yǎng)基的三角瓶中稀釋培養(yǎng)，培養(yǎng)光照強度為200 μmol/(m2·s)，其余培養(yǎng)條件與1.1 節(jié)中一致。將重新培養(yǎng)的藻液分別在0～10 d 取一定體積離心收集（4 500 r/min，5 min）藻體，對相關(guān)指標進行測定。

1.3 鹽生杜氏藻細胞干重的測定

藻細胞干重用濾膜法測定［15］。每組實驗樣品取出5～10 mL 藻液，用之前烘干（60 ℃，16 h）并預稱重的玻璃微纖維濾膜（沃特曼GF/C 濾膜，直徑47 mm）過濾，然后用0.5 mol/L NH4HCO3溶液（1～2 mL）洗滌3 次，烘干（60 ℃，16 h）后再次稱重，前后兩次的質(zhì)量差與藻液體積之比即為細胞干重。

1.4 葉綠素熒光及葉綠素含量的測定

葉綠素熒光指標采用葉綠素熒光成像系統(tǒng)Water-PAM進行測定，先將裝有待測樣品的測量杯避光暗處理10 min，然后進行Fv/Fm、ΦPSII 和NPQ 等指標的測定［16］。葉綠素采用乙醇法進行測定［17］，取少量樣品離心收集藻泥后加入1 mL無水乙醇，混勻后在78 ℃水浴鍋中加熱5 min，加熱后樣品放入避光環(huán)境中萃取葉綠素過夜，第二天樣品離心（4500 r/min，5 min）后取上清液200 μL，加入96孔中置于酶標儀中測定波長645 nm和665 nm的吸光度值，根據(jù)式（1）計算葉綠素a 的質(zhì)量濃度。

式中： Cchla為葉綠素a 的質(zhì)量濃度，mg/L；A665為葉綠素a 的吸光度值；A645為葉綠素b 的吸光度值；11.75和2.35為經(jīng)驗公式校正值。

1.5 β-胡蘿卜素含量的測定

改進的分光光度法用于測定生物質(zhì)中的β-胡蘿卜素含量［18］。將1 mL 細胞懸液在10 000 r/min下離心2 min。離心后，棄去上清液，加入3 mL正十二烷。劇烈搖動樣品以重新懸浮藻類顆粒，然后加入9 mL 甲醇以完全裂解細胞，再次劇烈搖動試管，然后以10 000 r/min離心2 min。用分光光度計（Jasco V-530，JASCO 公司，日本）以正十二烷作為參考，在453 nm和665 nm下測量含十二烷的親脂性β-胡蘿卜素（上層）。β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度計算見式（2）。

式中：Cβ-car為β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，mg/L；（（A453-A665）/3.91）是針對葉綠素校正的β-胡蘿卜素的吸光度；3.657 是從β-胡蘿卜素濃度的高效液相色譜分析得出的校準系數(shù)；3是為萃取而添加的十二烷的體積，mL；X 是在分光光度計上測量吸光度的稀釋倍數(shù)。

根據(jù)式（3）計算藻類生物量中β-胡蘿卜素的質(zhì)量百分數(shù)。

式中：fβ-car是β-胡蘿卜素質(zhì)量百分數(shù)，%；Cβ-car是β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度，mg/L；CBiomass是細胞生物量，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同劑量重離子輻照對鹽生杜氏藻生長的影響

如圖1所示：野生的鹽生杜氏藻株經(jīng)過寬劑量范圍（0～320 Gy）的重離子輻照處理后，藻細胞的生物量與重離子吸收劑量并無明顯的相關(guān)性。吸收劑量為60 Gy、120 Gy和180 Gy時，藻細胞生物量的積累顯著低于未輻照藻種的生物量。當吸收劑量為90 Gy、240 Gy和320 Gy時，生物量顯著高于未輻照藻細胞的生物量。其中，當吸收劑量為240 Gy時，生物量最高可達1.12 g/L，是對照藻細胞生物量的1.78倍。這與Wang等［6］進行的重離子對羊角月牙藻類（Selenastrum capricornutum）的輻照誘變實驗結(jié)果相似。

本研究中240 Gy 和320 Gy 輻照反而獲得了更好的有利誘變藻株。這與國內(nèi)外其他有關(guān)重離子在改良作物性狀方面的結(jié)論有所區(qū)別。如Niwa等［19］認為低于150 Gy的吸收劑量更適合條斑紫菜（Porphyra yezoensis）高產(chǎn)突變體的誘變；此外錢平平等［20］采用不同吸收劑量重離子輻照大蔥種子后，隨著吸收劑量的增加，發(fā)芽率和株高呈現(xiàn)拋物線的趨勢，這表明不同種屬的實驗材料對吸收劑量的耐受程度可能存在差異性。本研究初步表明：相對高的吸收劑量可能對鹽生杜氏藻有益誘變的引發(fā)更加有效，并因此提升了細胞的光合效率，從而提高了藻細胞生物量的積累。

圖1 不同劑量重離子輻照對鹽生杜氏藻生物量的影響Fig.1 Biomass of Dunaliella salina after irradiation with heavy ions at various doses

2.2 不同劑量重離子輻照對鹽生杜氏藻光合效率的影響

Fv/Fm可以表征微藻潛在的最大光合作用效率，以及光反應(yīng)中心PSII 的完整性，并且直接反映了微藻是否受到環(huán)境條件的脅迫［21］。如圖2（a）所示，鹽生杜氏藻在不同劑量重離子輻照后Fv/Fm的變化整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。各吸收劑量下，F(xiàn)v/Fm值在0～2 d 下降，2～4 d 上升，4～10 d 緩慢下降。相比于對照組（0 Gy）的變化趨勢，10 d后，240 Gy和320 Gy輻照誘變細胞的Fv/Fm值得到了顯著提升，表明該組輻照處理的細胞可能獲得了更多的有利誘變，使其光合作用效率得到了有效的提升，這與Wang 等［12］的研究結(jié)果相似。我們同時對輻照處理后藻細胞的實際光合活性參數(shù)ΦPSII的變化趨勢進行了測定和分析（圖2（b）），結(jié)果表明，ΦPSII在整個輻照處理后10 d內(nèi)的變化趨勢與Fv/Fm值基本一致，整體呈現(xiàn)先減小后增加再下降的變化趨勢，其中，90 Gy和240 Gy處理后10 d的ΦPSII值顯著高于對照組（p＜0.05）。

NPQ 參數(shù)是指非光化學淬滅能力，當微藻細胞接收到的光子超過自身所利用的光子時，便會以熱輻射效應(yīng)（即通過熒光和熱量的形式）將多余的光子釋放出去，保護微藻細胞免受光損傷［6，12］。NPQ 既反映了光系統(tǒng)對激發(fā)能的熱耗散水平，同時還能夠用來表征微藻葉綠體類囊體膜的激發(fā)狀態(tài)和光保護能力［22］。我們對不同吸收劑量重離子輻照鹽生杜氏藻處理后10 d 內(nèi)NPQ 的變化趨勢進行了測定和分析。如圖2（c），所有處理組的NPQ 整體呈現(xiàn)先增加后降低再增加的趨勢，輻照后2 d 內(nèi)，鹽生杜氏藻即啟動了光保護機制，此周期內(nèi)，200 μmol/(m2·s)的正常培養(yǎng)光強已經(jīng)超過微藻細胞的光利用能力。與對照組（0 Gy）相比，30 Gy、60 Gy、120 Gy 和180 Gy 輻照處理的藻細胞的NPQ 水平都大幅上升，表明這些輻照處理的藻細胞的光合系統(tǒng)受到了更嚴重的損傷，而240 Gy輻照處理的藻細胞的NPQ水平則相對較低。而在此后2～8 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，所有藻細胞的NPQ值逐步下降（2～4 d）并恢復到了穩(wěn)定狀態(tài)（4～8 d）。在整個恢復周期內(nèi)，240 Gy 輻照處理的藻細胞始終維持了比對照組更低的NPQ 值。因此，240 Gy輻照處理的藻細胞表現(xiàn)出低的NPQ 值，可能是由于輻照導致了葉綠體結(jié)合蛋白的過表達，進而使類囊體膜發(fā)生了重組，提升了光能轉(zhuǎn)換效率，并因此有效降低了藻細胞的熱耗散能量［12］，致使藻細胞更快地啟動了光保護機制，在光反應(yīng)階段完成了更多光能的轉(zhuǎn)換，有效地提升了光能利用效率，積累了更多的細胞生物量和代謝產(chǎn)物。

不同吸收劑量引發(fā)的微藻細胞光合作用效率的差異可能歸因于以下兩個重要的因素：其一是誘變后，細胞可能通過光電子傳遞速率和熱耗散能力的調(diào)控實現(xiàn)了能量的動態(tài)平衡，進而影響了微藻細胞整體光合作用效率的差異［12］；其二，Bonente 等［23］的研究表明，藍藻細胞受到損傷后，細胞啟動的修復機制導致光能捕獲通路中相關(guān)色素合成基因和色素結(jié)合蛋白的表達發(fā)生了改變，介導PSII 的修復機制來提高光合作用的能力進而影響了微藻細胞整體光合效率。

圖2 不同劑量重離子輻照對鹽生杜氏藻的葉綠素熒光參數(shù)的影響：(a)Fv/Fm；(b)ΦPSII；(c)NPQFig.2 Chlorophyll fluorescence parameters of Dunaliella salina after irradiation with heavy ions at various doses:(a)Fv/Fm;(b)ΦPSII;(c)NPQ

2.3 不同劑量重離子輻照對鹽生杜氏藻色素積累的影響

鹽生杜氏藻細胞受不同劑量重離子輻照處理后，我們對10 d內(nèi)藻細胞中葉綠素a的含量變化進行了跟蹤檢測。如圖3（a）所示，葉綠素a含量呈現(xiàn)先升高后降低的整體趨勢，其中90 Gy、240 Gy和320 Gy 輻照處理后的藻細胞葉綠素a 在2 d 內(nèi)的積累量顯著高于對照組（0 Gy），在隨后的培養(yǎng)周期內(nèi)逐漸降低，但這3個處理的藻細胞葉綠素a積累量始終高于對照組。由圖3（c）得知，其中在240 Gy 和320 Gy 輻照處理的藻細胞后葉綠素a 產(chǎn)量在第10 d 內(nèi)的積累量顯著高于對照組（0 Gy），同時，240 Gy 和320 Gy 組葉綠素a 產(chǎn)量之間并無顯著性差異（p＞0.05）。

本研究同時探究了不同劑量重離子輻照后鹽生杜氏藻細胞內(nèi)的β-胡蘿卜素含量的變化。如圖3（b）所示，在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，β-胡蘿卜素的積累呈現(xiàn)增加的趨勢，其中90 Gy、240 Gy和320 Gy在10 d 內(nèi)的β-胡蘿卜素積累量顯著高于對照組（p＜0.05）。其中，對照組中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為10.8 mg/L，90 Gy、240 Gy和320 Gy在10 d內(nèi)的β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別為17.7 mg/L、24.8 mg/L 和22.9 mg/L（圖3（d）），與對照組（0 Gy）相比，兩個高劑量重離子輻照240 Gy 和320 Gy 處理后的鹽生杜氏藻細胞內(nèi)β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了1.3倍和1.1倍（圖3（d）），而其他吸收劑量（30 Gy、60 Gy、120 Gy、180 Gy）處理的藻細胞內(nèi)β-胡蘿卜素積累量則顯著低于對照組。這與葉綠素a積累量的變化趨勢具有相似性。β-胡蘿卜素作為捕光色素蛋白復合物的重要組成之一，在淬滅激發(fā)態(tài)的3Chl*分子中發(fā)揮重要作用，同時β-胡蘿卜素還可以消除產(chǎn)生的過多自由基，保護微藻細胞免受氧化損傷［9］。相關(guān)研究表明，重離子輻射從開始照射到生物損傷的過程大致可以分為4 個階段：物理階段、化學階段、生化階段和生物階段。在物理階段，射線的能量在極短的時間（10-16s）內(nèi)沉積在生物體中，使生物分子和生物介質(zhì)中的水分子發(fā)生電離和激發(fā)，產(chǎn)生大量的自由基；在化學階段，自由基與多種生物分子相互作用引起鏈式反應(yīng)（通常在10-3s內(nèi)），最終導致生物分子尤其是DNA分子結(jié)構(gòu)和功能的改變［5，19］。β-胡蘿卜素作為效應(yīng)分子可能參與了微藻細胞光合效率的動態(tài)調(diào)控［24］。通過β-胡蘿卜素的大量積累有效地抵制和清除了過量自由基對細胞的損傷。此前相關(guān)報道證明，重離子輻照可以更高效地引發(fā)DNA 斷裂、重組和突變，并因此提升有利突變的概率［6，25-26］。我們推測，重離子輻照高劑量誘變可能致使藻細胞中β-胡蘿卜素代謝通路中的相關(guān)基因表達上調(diào)，也可能β-胡蘿卜素合成途徑中的相關(guān)酶通過誘變積累了更多的有利突變，活性得到了提升。我們在后續(xù)的研究中，將對該誘變藻株在轉(zhuǎn)錄組和代謝組水平上進行進一步深入的研究。

圖3 不同劑量重離子輻照對鹽生杜氏藻的色素含量的影響：(a)葉綠素a含量；(b)β-胡蘿卜素含量；(c)葉綠素a 產(chǎn)量；(d)β-胡蘿卜素產(chǎn)量Fig.3 Pigment of Dunaliella salina after irradiation with heavy ions at various doses:(a)Chl a content;(b)β-carotene content;(c)Chl a yield;(d)β-carotene yield

3 結(jié)論

本文初步探討了重離子輻照對鹽生杜氏藻的生物學效應(yīng)及藻細胞對輻照損傷的光合響應(yīng)機制。結(jié)果表明：高吸收劑量的輻照對鹽生杜氏藻具有更好的誘變效應(yīng)，240 Gy 吸收劑量顯著提高了鹽生杜氏藻的生物量，產(chǎn)量最高可達1.1 g/L。同時240 Gy 和320 Gy 吸收劑量有效提高了鹽生杜氏藻的Fv/Fm、ΦPSII，同時使藻細胞獲得了更低的NPQ。表明藻細胞受到誘變損傷后，會通過熱耗散效應(yīng)啟動能量的動態(tài)調(diào)控。其中，240 Gy 的吸收劑量有效誘導了鹽生杜氏藻細胞中代謝產(chǎn)物β-胡蘿卜素的積累，產(chǎn)量最高達到24.8 mg/L，比對照組提高了1.3 倍，β-胡蘿卜素的高效積累能使其有效清除活性氧自由基，阻止了重離子輻照對光合系統(tǒng)的損傷，是鹽生杜氏藻對重離子輻照的另外一種重要響應(yīng)機制。