寧亞維，蘇 丹，付浴男，劉楊柳，王志新，賈英民,

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

為了防止食品腐敗變質(zhì)，食品加工過程中通常通過添加防腐劑進(jìn)行防腐保鮮，其中最常用的為化學(xué)防腐劑。但隨著人們對食品安全逐漸重視，化學(xué)防腐劑的安全性受到質(zhì)疑，天然防腐劑受到青睞[1-2]。目前研究較多的天然防腐劑主要包括各類植物提取物（如植物精油、迷迭香、大蒜素等）和抗菌肽[3-4]。多數(shù)植物提取物如精油和大蒜素等由于添加后會影響食品本身的風(fēng)味而需要進(jìn)行包埋等修飾，這無疑提高了生產(chǎn)成本。抗菌肽主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，具有生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)勢，在食品防腐領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用潛力?？咕腷revilaterin是由側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)生的一種小分子肽，具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點[5]。研究發(fā)現(xiàn)brevilaterin對革蘭氏陰性菌的抑菌能力較陽性菌弱，單獨使用時存在用量大的問題，因此在食品中要實現(xiàn)廣譜抑菌則需要增加使用劑量，導(dǎo)致成本增加。

具有協(xié)同作用的防腐劑聯(lián)合使用，可提高防腐劑的抗菌活性，降低單一防腐劑的使用量[6]。為了降低抗菌肽在食品中的使用量，本課題組對多種天然防腐劑進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)檸檬酸與brevilaterin聯(lián)用對大腸桿菌（Escherichia coli）具有協(xié)同抑菌效應(yīng)，聯(lián)合使用可增強(qiáng)其抑菌活性[7]。檸檬酸在食品中主要作為酸味調(diào)節(jié)劑使用，但是研究也發(fā)現(xiàn)其可以作為協(xié)同抑菌劑來提高Nisin的抑菌活性[8-9]。Campion等[10]發(fā)現(xiàn)檸檬酸與Nisin復(fù)配使用可有效降低嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的數(shù)量。Oladunjoye等[11]研究表明檸檬酸、Nisin聯(lián)合使用對番茄切片中的單核細(xì)胞增生李斯特菌具有協(xié)同控制作用。檸檬酸與抗菌肽聯(lián)用可發(fā)揮雙功能性，即酸味調(diào)節(jié)和抑菌作用。因此，抗菌肽和檸檬酸聯(lián)合使用在食品中具有較好的應(yīng)用前景，然而兩者聯(lián)用的抑菌機(jī)理尚不明確。

大腸桿菌是一種常見的食源性致病菌，不僅會造成食品腐敗變質(zhì)，還會通過污染食品感染人類，引起食源性疾病。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心報道，產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌每年導(dǎo)致超過26.5萬人患?。?016年，美國報告了5 441 例產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希氏菌感染病例，包括2 323 例O157和3 104 例非O157病例，且與2015年相比非O157感染率增加了15%[12]。因此，控制食品中的食源性致病菌——大腸桿菌具有重要意義。

本研究以食源性致病菌大腸桿菌為指示菌，通過時間-殺菌曲線考察了brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌的協(xié)同抑菌效應(yīng)，從細(xì)胞膜損傷（如跨膜電勢、膜完整性、菌體超微結(jié)構(gòu)），菌體蛋白質(zhì)合成以及對細(xì)菌DNA的影響三方面研究了brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌的協(xié)同抑菌機(jī)理，以期為抗菌肽brevilaterin與檸檬酸在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

brevilaterin由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室制備[13]；大腸桿菌ATCC 44752由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室保藏。

檸檬酸 天津永大化學(xué)試劑有限公司；DiSC3(5)美國Sigma公司；LIVE/DEAD BacLight細(xì)菌活力試劑盒 美國Thermo Fisher Scientific公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker、DNA Ladder 北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；瓊脂糖G-10 上海玉博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Evolution 220型紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；SepctraMax Plus 384型酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司；F-7000-FL型熒光分光光度計、H-7650型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；Accuri C6 plus型流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53型熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 時間-殺菌曲線繪制

將生長至對數(shù)期的大腸桿菌懸液與不同抑菌劑組混合，使菌懸液終濃度為5×105CFU/mL，brevilaterin終濃度分別為160 AU/mL（最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC））、40 AU/mL（1/4 MIC），檸檬酸終質(zhì)量濃度分別為1.25 mg/mL（MIC）、0.312 5 mg/mL（1/4 MIC），聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC），以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水作為空白對照。將各處理組置于37 ℃孵育一定時間后，取出涂布平板并于37 ℃培養(yǎng)18 h后進(jìn)行活菌菌落計數(shù)。

1.3.2 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌跨膜電勢的影響

參考Lee等[14]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（含10 mmol/L葡萄糖、100 mmol/L氯化鉀，pH 7.2）清洗并重懸為2×108CFU/mL的菌懸液。將膜電位探針DiSC3(5)添加到菌懸液中（終濃度為1 μmol/L）于30 ℃避光孵育15 min。在比色皿中加入菌懸液與等體積各濃度的抑菌劑（brevilaterin（1/4 MIC）組與MIC組，檸檬酸（1/4 MIC）組與MIC組，以及聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）），以無菌水作為空白對照，以纈氨霉素（valinomycin，Val）為陽性對照，尼日利亞菌素（nigericin，Nig）為陰性對照，終濃度均為10 μmol/L。利用熒光分光光度計進(jìn)行掃描，其中激發(fā)波長為650 nm，發(fā)射波長為672 nm。

1.3.3 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

參考Wang Yao等[15]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌用生理鹽水清洗、重懸制備為濃度為2×108CFU/mL的菌懸液。將等體積的菌懸液與不同濃度抑菌劑混合。在37 ℃條件下孵育1 h，然后用生理鹽水清洗、重懸。以生理鹽水作為陰性對照，以體積分?jǐn)?shù)70%異丙醇作為陽性對照。向上述菌懸液中加入SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（終濃度為2 μmol/L）并于30 ℃條件下避光孵育15 min。最后通過生理鹽水清洗、重懸后，分別采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)分析與拍照觀察。

1.3.4 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的影響

參考Liu Hongxia等[16]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗、重懸制備菌懸液，然后分別向菌懸液（終濃度為2×108CFU/mL）中加入各組抑菌劑，以PBS作為空白對照。37 ℃下培養(yǎng)1 h后，用PBS清洗兩遍，然后用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛4 ℃固定過夜。再用體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸在4 ℃固定4 h，不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、80%、90%）的丙酮逐級脫水，再用無水丙酮置換兩次。用包埋劑包埋、聚合后進(jìn)行超薄切片，采用醋酸雙氧鈾進(jìn)行染色后，采用TEM觀察。

1.3.5 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌蛋白質(zhì)合成的影響

參考Ning Houqi等[17]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌用生理鹽水清洗、重懸。將菌懸液與抑菌劑混合使其終濃度為108CFU/mL，并于37 ℃條件下培養(yǎng)1 h。用生理鹽水清洗、重懸至300 μL，加入4×蛋白上樣緩沖液900 μL，在100 ℃沸水中加熱5 min后，放至室溫離心后備用。制備凝膠（10%的分離膠與4%的濃縮膠），安裝好電泳裝置后，于上樣孔中加樣10 μL，調(diào)節(jié)電壓至80 V開始十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后120 V跑至膠底。將膠塊放置于染色液（考馬斯亮藍(lán)G250 1 g/L、45%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇、10%冰醋酸、45%蒸餾水）中搖床染色20 min后，放入脫色液（10%甲醇、10%冰醋酸、80%蒸餾水）中進(jìn)行搖床脫色，直至條帶清晰后使用凝膠成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.3.6 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細(xì)菌DNA的影響

采用DNA試劑盒提取大腸桿菌基因組DNA，使用超微量紫外分光光度計測定所提DNA的質(zhì)量濃度（62.4 μg/mL）和純度（OD260nm/OD280nm＝1.83）。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的瓊脂糖凝膠，其中加入4S Red Plus核酸染色劑（終劑量為0.1 μL/mL）。將DNA與各濃度抑菌劑混合（DNA終質(zhì)量濃度為31 μg/mL），在37 ℃下水浴30 min后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用凝膠成像儀拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)3 次取其平均值。采用Origin 8.0軟件通過單因素方差分析法對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌的時間-殺菌曲線

通過時間-殺菌曲線研究了brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用組合的抑菌動力學(xué)，從圖1可以看出，brevilaterin、檸檬酸的MIC組和聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）在24 h內(nèi)均呈現(xiàn)抑菌效果，且聯(lián)用組較brevilaterin（1/4 MIC）與檸檬酸（1/4 MIC）單獨使用的菌落數(shù)有明顯下降，結(jié)果證實brevilaterin（1/4 MIC）與檸檬酸（1/4 MIC）聯(lián)用具有協(xié)同抑菌效果。

圖1 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌的時間-殺菌曲線Fig. 1 Time-killing curve of brevilaterin in combination with citric acid against E. coli

2.2 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細(xì)胞跨膜電勢的影響

DiSC3(5)是一種膜電位敏感染料，能夠在完整的極化細(xì)胞膜中累積，處于自猝滅狀態(tài)；當(dāng)膜電位被破壞時，染料被釋放到介質(zhì)中，DiSC3(5)熒光強(qiáng)度增加[18-19]。因此采用DiSC3(5)考察大腸桿菌細(xì)胞膜電勢的變化。如圖2所示，陰性對照組（Nig）、空白對照組熒光強(qiáng)度無明顯變化，而陽性對照組（Val）可有效提高鉀離子的擴(kuò)散速率，從而消散膜電位，使熒光強(qiáng)度增加。brevilaterin（1/4 MIC）組熒光強(qiáng)度無明顯變化，brevilaterin（MIC）組熒光強(qiáng)度明顯增加（從230增加至320左右），說明其會消散膜電位。1/4 MIC檸檬酸和MIC檸檬酸組熒光強(qiáng)度均增加，但兩者無顯著差異，表明1/4 MIC和MIC檸檬酸均可以導(dǎo)致細(xì)胞膜電勢消散，且1/4 MIC和MIC檸檬酸對細(xì)胞膜電勢的消散程度無顯著差異。聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）的熒光強(qiáng)度隨時間的延長不斷增強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度明顯高于brevilaterin（MIC）組與檸檬酸（MIC）組的熒光強(qiáng)度。因此可推測，brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌膜電勢有協(xié)同消散作用。

圖2 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌細(xì)胞跨膜電勢的影響Fig. 2 Influence of brevilaterin combined with citric acid on transmembrane potential of E. coli

2.3 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖3 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性影響的流式細(xì)胞圖Fig. 3 Effect of brevilatein combined with citric acid on the membrane integrity of E. coli determined by flow cytometry

利用SYTO 9和PI熒光探針研究brevilaterin與檸檬酸對細(xì)胞膜完整性的影響[20-21]。SYTO 9探針可以標(biāo)記所有細(xì)菌，而PI只能標(biāo)記細(xì)胞膜受損的細(xì)菌[22]；當(dāng)兩種染料同時存在時，PI會與SYTO 9發(fā)生競爭性結(jié)合導(dǎo)致SYTO 9染色熒光的減弱。如圖3所示，空白對照組膜受損率為3.3%，brevilaterin（1/4 MIC）組的膜受損率達(dá)到了66.7%，brevilaterin（MIC）組的膜受損率較高，為98.1%；檸檬酸（1/4 MIC）組的膜受損率20.7%，檸檬酸（MIC）組的膜受損率為60.0%，聯(lián)合使用組的膜受損率高達(dá)99.5%。因此，上述結(jié)果表明brevilaterin（MIC）基本能夠破壞全部細(xì)胞的膜完整性，檸檬酸（MIC）僅能破壞部分細(xì)胞的膜完整性，聯(lián)用組的膜受損率高于二者單獨作用，說明brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌的膜完整性具有協(xié)同破壞作用。

從圖4可以觀察到，未經(jīng)抑菌劑處理的對照組細(xì)胞僅被SYTO 9染色，發(fā)出綠色熒光，表明細(xì)胞膜完整，而經(jīng)過brevilaterin（1/4 MIC）組處理后，60%以上細(xì)胞發(fā)出紅色熒光；經(jīng)過brevilaterin（MIC）組處理后，幾乎所有細(xì)胞都發(fā)出橙紅色熒光。經(jīng)過檸檬酸（1/4 MIC）組處理后，大多數(shù)細(xì)胞為綠色，而經(jīng)過檸檬酸（MIC）組處理后，50%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，表明檸檬酸處理后的細(xì)胞膜受損率較brevilaterin（MIC）組小。而聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）細(xì)胞幾乎全部發(fā)出橙紅色熒光，說明幾乎所有的細(xì)胞膜完整性受到破壞，上述結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致。

圖4 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性影響的熒光顯微圖Fig. 4 Effect of brevilatein combined with citric acid on the membrane integrity of E. coli observed by fluorescence microscopy

2.4 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的影響

通過TEM觀察brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌菌體形態(tài)變化的影響，結(jié)果如圖5所示，空白對照組菌體形態(tài)完好、內(nèi)容物完整；brevilaterin（MIC）組的細(xì)胞發(fā)生形變、質(zhì)壁分離、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏等變化[23]；檸檬酸（MIC）組細(xì)胞膜邊緣模糊且細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，表明brevilaterin和檸檬酸均可以破壞細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。此外，brevilaterin（1/4 MIC）組部分細(xì)胞受損（與時間-殺菌曲線顯示的部分抑菌效果一致），細(xì)胞內(nèi)局部出現(xiàn)空腔，檸檬酸（1/4 MIC）組無顯著影響，但聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）處理后細(xì)胞發(fā)生形變，菌體內(nèi)出現(xiàn)空洞，表明brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)有協(xié)同破壞效應(yīng)。

圖5 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)影響的TEM圖Fig. 5 Effect of brevilatein combined with citric acid on the ultrastructure of E. coli examined by TEM

2.5 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌蛋白質(zhì)合成的影響

蛋白質(zhì)在細(xì)胞代謝與物質(zhì)合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此考察了brevilaterin與檸檬酸對蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。通過SDS-PAGE分析考察大腸桿菌的蛋白質(zhì)條帶變化，如圖6所示，brevilaterin（MIC）組（泳道6）在分子質(zhì)量31 kDa附近有一個條帶顏色加深（箭頭處），其他條帶均無明顯變化，可能是由于高濃度的brevilaterin促進(jìn)了此分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的合成。上述結(jié)果表明brevilaterin、檸檬酸對蛋白質(zhì)表達(dá)無顯著影響。

圖6 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌蛋白質(zhì)合成影響的SDS-PAG圖Fig. 6 Effect of brevilatein combined with citric acid on protein synthesis in E. coli evaluated by SDS-PAGE

2.6 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌DNA的影響

DNA是最重要的遺傳物質(zhì)之一，DNA的損傷會影響基因的表達(dá)，導(dǎo)致酶和受體蛋白質(zhì)等合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。從圖7可以看出，空白對照組的DNA條帶亮度最強(qiáng)，brevilaterin（1/4 MIC）和brevilaterin（MIC）組條帶亮度與對照組相比輕微減弱；檸檬酸（1/4 MIC）組DNA條帶亮度明顯降低，檸檬酸（MIC）處理組的DNA條帶彌散消失；聯(lián)用組的DNA條帶亮度較brevilaterin（1/4 MIC）、檸檬酸（1/4 MIC）顯著降低。結(jié)果表明，檸檬酸對大腸桿菌菌體DNA具有較強(qiáng)的降解作用，brevilaterin和檸檬酸聯(lián)用組對DNA具有協(xié)同降解作用。

圖7 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌 DNA影響的凝膠阻滯圖Fig. 7 Effect of brevilatein combined with citric acid on DNA of E. coli evaluated by gel retardation

3 討 論

近年來，抗菌肽作為天然防腐劑愈來愈受到人們青睞，且天然防腐劑之間復(fù)配使用因可有效提高抗菌活性，降低使用量而受到人們關(guān)注。Khorsandi等[25]研究發(fā)現(xiàn)Nisin與天然防腐劑聯(lián)用可有效延長香腸貨架期；Shi Ce等[26]研究發(fā)現(xiàn)Nisin與肉桂醛聯(lián)用對巴氏殺菌奶中的金黃色葡萄球菌有很好的協(xié)同抑菌效果；Najjar等[27]研究發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸與Nisin A聯(lián)用可以有效抑制人體口腔中的變形鏈球菌的生長。Jia Shiliang等[28]發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸與低溫貯藏可延緩太平洋白蝦變質(zhì)。本研究所考察的brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌具有較好的協(xié)同抑制作用，且聯(lián)用可降低brevilaterin與檸檬酸單獨使用的劑量，在食品防腐中具有較大的應(yīng)用潛力。

目前，關(guān)于抗菌肽的機(jī)理研究已有大量報道，抗菌肽主要作用于微生物細(xì)胞膜，如在細(xì)胞膜上形成離子通道、跨膜孔，造成膜大面積破裂，最終導(dǎo)致微生物細(xì)胞的裂解；同時，抗菌肽也可能會破壞靶向DNA和伴侶蛋白，改變細(xì)胞質(zhì)膜隔膜的形成，抑制細(xì)胞壁合成，減少核酸合成，抑制蛋白質(zhì)合成或抑制酶的活性[29-30]?；诖?，本實驗通過細(xì)胞壁膜、蛋白質(zhì)合成和核酸合成對brevilaterin的抑菌機(jī)理進(jìn)行研究。通過細(xì)菌跨膜電勢、細(xì)胞膜通透性實驗和菌體超微結(jié)構(gòu)觀察分析發(fā)現(xiàn)抗菌肽brevilaterin、檸檬酸均對大腸桿菌細(xì)胞膜有破壞作用；通過對菌體DNA影響的研究發(fā)現(xiàn)brevilaterin、檸檬酸對菌體DNA有降解作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，brevilaterin與檸檬酸相比對大腸桿菌膜的破壞性較強(qiáng)，推測可能與其作用方式有關(guān)，即抗菌肽在細(xì)胞膜表面形成跨膜孔增大了細(xì)胞膜的通透性。

綜上，brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌具有協(xié)同抑菌作用，可以通過消散細(xì)胞跨膜電勢，破壞細(xì)胞膜完整性，造成菌體DNA降解和細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。本研究為brevilaterin與檸檬酸復(fù)配組合在食品防腐中的應(yīng)用中提供了理論參考。