劉衛(wèi)華，楊 茜，劉敏軒，于文龍，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）是第3代氯霉素類抗生素，于1988年誕生于美國，1999年在我國被批準(zhǔn)為二類新獸藥。FF殺菌譜廣，可以有效殺滅厭氧革蘭氏陽性菌及陰性菌[1]，并且用藥后基本不再產(chǎn)生再生性貧血障礙[2-3]，目前已代替氯霉素（chloramphenicol，CAP），廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)[4-9]。FF的過度使用，不但會(huì)導(dǎo)致用藥動(dòng)物身體機(jī)能的下降，還會(huì)引起一系列人畜共患的細(xì)菌性疾病，F(xiàn)F的肝毒性和耐藥性等致病因素也極有可能轉(zhuǎn)移到人體中，埋下健康隱患[10-16]。對(duì)此，我國和歐盟都對(duì)動(dòng)物肌肉中FF的殘留作出了限量規(guī)定，最大限量均為300 μg/kg，最小限量為100 μg/kg[17-18]。

近年來，多地市場(chǎng)的肉類、蛋類商品被查出FF殘留超標(biāo)[19]，建立動(dòng)物性食品中FF殘留的快速篩查方法也成為了研究熱點(diǎn)。

目前，最常用的FF檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-22]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[23-24]、氣相色譜法等儀器檢測(cè)方法[25-27]以及免疫分析法[28-30]。這些檢測(cè)方法雖然有很高的靈敏度，但因儀器不便攜、檢測(cè)成本高，無法實(shí)現(xiàn)樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因此需要研發(fā)FF殘留的快速檢測(cè)方法。電化學(xué)方法因具有儀器便攜、成本低、檢測(cè)周期短、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在農(nóng)獸藥殘留、致病微生物等檢測(cè)領(lǐng)域中。高牧叢等[31]基于石墨烯（graphene，GR）-殼聚糖（chitosan，CS）復(fù)合材料制備了用于檢測(cè)尿酸的電化學(xué)免疫傳感器。在6～600 μmol/L線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2為0.993 4，檢出限為0.33 μmol/L（RSN=3），添加回收率在97.5%～101.3%之間。Qi Shaopeng等[32]制備了一種基于GR的萊克多巴胺（ractopamine，RAC）免疫傳感器，通過GR與RAC分子間的π-π吸附作用將RAC固定在GR表面，實(shí)現(xiàn)了RAC的特異性檢測(cè)。在0～4 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍，RAC檢出限為0.06 ng/mL，實(shí)際豬肉樣品的加標(biāo)回收率在93.6%～113.6%之間。Jijie等[33]建立了用于檢測(cè)致病性大腸桿菌的免疫傳感器。通過電沉積在金電極表面修飾了還原氧化石墨烯-聚乙烯亞胺復(fù)合薄膜，大腸桿菌的線性濃度范圍為1×101～1×104CFU/mL，相關(guān)系數(shù)為0.995，檢出限為10 CFU/mL，且特異性較好、靈敏度較高，可以用于實(shí)際血清、尿液和水樣品的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)開發(fā)一種基于GR-CS復(fù)合修飾材料的電化學(xué)免疫傳感器，依據(jù)抗原和抗體的特異性結(jié)合，旨在建立檢測(cè)FF的電化學(xué)方法，應(yīng)用于肉類和雞蛋樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、雞肉、雞蛋，購于河北省保定市。

FF、CAP、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海源葉生物科技有限公司；氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA）德國Witega公司；FF多克隆抗體（anti-FF）由本實(shí)驗(yàn)室自制（效價(jià)1∶60 000，IC15為0.72 ng/mL，親和性較好）；CS 北京索萊寶科技有限公司；GR 北京德科島金科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E型電化學(xué)工作站、CHI 104 3 mm直徑玻碳盤電極（glass carbon disk electrode，GCE）、CHI 115鉑絲對(duì)電極、CHI 150飽和甘汞電極 上海辰華儀器有限公司；SKP-02.300電熱恒溫培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LCT Premier XE液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 GR-CS復(fù)合材料的制備及表征

準(zhǔn)確量取50.0 mL 0.05 mol/L HCl溶液，于恒溫水浴鍋中加熱至80～90 ℃，隨后加入準(zhǔn)確稱取的50.0 mg CS粉末，攪拌溶解。溶解后取出冷卻至室溫，加入0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 5，配制成1 mg/mL的CS溶液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確稱取3.0 mg GR粉末，加入到1.0 mL配制好的1 mg/mL CS溶液中，超聲分散2 h，得到均勻分散的GR-CS混懸體系，質(zhì)量濃度為3 mg/mL，置于4 ℃保存。

采用掃描電子顯微鏡觀察GR粉末和GR-CS復(fù)合修飾材料的形態(tài)。

1.3.2 GCE裸電極的修飾

GCE裸電極在使用前依次用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁粉在拋光絨布上拋光打磨，直至呈現(xiàn)光滑鏡面。隨后分別在硝酸溶液和乙醇溶液和去離子水中超聲，室溫下晾干。在pH 7.0含0.1 mol/L KCl和10 mmol/L K3Fe(CN)6的磷酸鹽測(cè)試溶液（0.1 mol/L KCl ＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS）中進(jìn)行循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法掃描，電位差不超過90 mV后，用移液槍移取10 μL制備好的GR-CS復(fù)合修飾材料，垂直滴涂于GCE裸電極表面，在室溫下過夜晾干，得到GR-CS/GCE。

1.3.3 免疫傳感器的制備

用移液槍移取10 μL稀釋好的anti-FF，垂直滴涂于GR-CS/GCE表面，立即放入恒溫培養(yǎng)箱中在37 ℃溫育1 h，得到anti-FF/GR-CS/GCE。再移取10 μL的5% BSA溶液，垂直滴涂于anti-FF/GR-CS/GCE表面，37 ℃繼續(xù)溫育1 h，得到BSA/anti-FF/GR-CS/GCE，并用CV法對(duì)修飾電極進(jìn)行表征。

將含有FF的待測(cè)樣液取10 μL垂直滴涂在BSA/anti-FF/GR-CS/GCE表面，37 ℃進(jìn)行溫育。采用三電極體系，以BSA/anti-FF/GR-CS/GCE為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，在0～0.6 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法掃描測(cè)定，在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS測(cè)試溶液中進(jìn)行DPV掃描，記錄峰值電流。

1.3.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

參照GB/T 20756—2006《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[34]，對(duì)預(yù)先經(jīng)檢測(cè)無FF的豬肉、牛肉、雞肉、雞蛋（分為全蛋、蛋黃和蛋清3 個(gè)測(cè)試組）樣品進(jìn)行預(yù)處理。

稱取5.0 g試樣（精確至0.01 g），分別加入FF標(biāo)準(zhǔn)液75 μL，15 mL乙酸乙酯和5 g無水硫酸鈉，均質(zhì)提取后4 000 r/min離心5 min，用乙酸乙酯定容至50 mL。取10 mL提取液于雞心瓶中，45 ℃旋蒸至干，殘?jiān)? mL去離子水溶解并超聲，加入3 mL正己烷渦旋混合，靜置分層，移取1 mL水相于1.5 mL聚丙烯離心管中，13 000 r/min離心5 min，過0.2 μm濾膜后，待測(cè)。

取10 μL待測(cè)樣液垂直滴涂在BSA/anti-FF/GRCS/GCE表面，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行DPV掃描，記錄峰值電流。

1.3.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)FF

C18色譜柱；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水（40∶60，V/V）溶液；電噴霧電離源；掃描方式為負(fù)離子模式。

配制質(zhì)量濃度梯度為1、10、100、200、300、500、700、1 000 ng/mL的FF標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制FF標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品待測(cè)液20 μL進(jìn)行檢測(cè)，并與電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果擬合。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳感器的制備原理

FF免疫傳感器的制備原理如圖1所示。GCE經(jīng)拋光打磨處理干凈后，在電極表面垂直滴涂GR-CS，室溫下過夜晾干。再將一定質(zhì)量濃度的anti-FF包被在電極表面，恒溫溫育后用BSA封閉電極表面剩余的活性位點(diǎn)。將一定質(zhì)量濃度的FF標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂在電極表面，使FF分子與anti-FF發(fā)生特異性結(jié)合，電極表面的電子傳遞因抗原-抗體結(jié)合產(chǎn)生大分子的結(jié)合產(chǎn)物而受到阻礙，從而導(dǎo)致電流發(fā)生變化，并以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[35]。

圖1 FF免疫傳感器的制備原理圖Fig.1 Schematic of the preparation of immunosensor for florfenicol detection

2.2 GR-CS復(fù)合材料的表征

由圖2A可以看出，GR表面存在許多孔穴，使其可以吸附抗體等物質(zhì)，但卻因其片狀結(jié)構(gòu)而易相互重疊。由圖2B可以看出，CS因其特有的分散性和成膜性，使GR粉末良好地分散，形成一層均勻的導(dǎo)電薄膜。

圖2 GR粉末（A）和GR-CS復(fù)合修飾材料（B）的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of GR (A) and GR-CS composite (B)

2.3 不同修飾過程中電極的表征

圖3 不同修飾電極的CV曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

采用CV法對(duì)不同修飾過程中電極表面的電化學(xué)行為進(jìn)行表征。將不同修飾的電極在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的測(cè)試液中進(jìn)行CV掃描，得到CV曲線（圖3）。GCE裸電極（曲線d）經(jīng)過拋光打磨處理后，出現(xiàn)了一對(duì)可逆的氧化還原峰，且峰值電流最?。辉贕CE電極表面修飾上GR-CS后（曲線a），峰值電流明顯增大，說明電極表面電子傳遞速率得到顯著增強(qiáng)；進(jìn)一步修飾上anti-FF后（曲線b），峰值電流降低，說明抗體分子阻礙了電極表面電子的傳遞，即anti-FF成功修飾在電極表面；修飾好的電極在5% BSA溶液中封閉1 h后（曲線c），峰值電流進(jìn)一步減小，說明BSA在電極表面上成功修飾，封閉了電極表面剩余的活性位點(diǎn)，傳感器構(gòu)建成功。

2.4 抗體質(zhì)量濃度的確定

電極表面抗體的質(zhì)量濃度是影響后續(xù)FF檢測(cè)步驟很重要的因素。為選擇一個(gè)最佳的抗體修飾質(zhì)量濃度，將不同質(zhì)量濃度的anti-FF垂直滴涂在GR-CS/GCE表面，滴涂量為10 μL，隨后在37 ℃溫育1 h，最后在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的測(cè)試液中進(jìn)行DPV掃描，電壓0～0.6 V、掃描速率0.05 V/s，靈敏度1×10－4。

由圖4可以看出，當(dāng)anti-FF質(zhì)量濃度為0～60 μg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPV峰值電流迅速降低，表明抗體分子正不斷地被固定在GR-CS/GCE表面；當(dāng)質(zhì)量濃度為60～120 μg/mL時(shí)，DPV峰值電流的變化趨于平緩，說明電極表面上抗體的固定量已趨于飽和；當(dāng)質(zhì)量濃度大于120 μg/mL時(shí)，電極表面上的抗體過多，阻礙了電子的傳遞。因此，選擇60 μg/mL為anti-FF的最佳修飾質(zhì)量濃度。

圖4 不同anti-FF質(zhì)量濃度下的DPV峰值電流Fig.4 DPV peak currents at different anti-FF antibody concentrations

2.5 溫育時(shí)間的確定

在anti-FF/GR-CS/GCE上滴涂10 μL稀釋后的FF標(biāo)準(zhǔn)品溶液，37 ℃溫育時(shí)間依次延長，在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的測(cè)試液中進(jìn)行DPV掃描，電壓0～0.6 V、掃描速率0.05 V/s，靈敏度1×10－4。

圖5 不同溫育時(shí)間下的DPV峰值電流Fig.5 DPV peak currents at different incubation times

如圖5所示，溫育時(shí)間在30～60 min范圍內(nèi)時(shí)，隨著溫育時(shí)間的延長，DPV峰值電流不斷增大，這表明免疫反應(yīng)產(chǎn)物的生成需要一定時(shí)間，并隨著時(shí)間的延長不斷地進(jìn)行；當(dāng)溫育時(shí)間繼續(xù)延長至60 min以上，DPV峰值電流變化趨于平緩，這表明抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物已趨于穩(wěn)定，免疫反應(yīng)已基本達(dá)到終點(diǎn)。因此，選擇60 min為最佳的溫育時(shí)間。

2.6 FF標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

在GR-CS/GCE表面分別垂直滴涂10 μL質(zhì)量濃度為60 μg/mL的anti-FF，37 ℃溫育1 h后用1×PBS清洗，隨后用5% BSA溶液37 ℃封閉1 h，1×PBS清洗后，垂直滴涂不同質(zhì)量濃度的FF標(biāo)準(zhǔn)溶液，37 ℃溫育1 h后，在測(cè)試液0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中進(jìn)行DPV掃描，電壓0～0.6 V、掃描速率0.05 V/s，靈敏度1×10－4。

DPV峰值電流與FF質(zhì)量濃度呈反比，F(xiàn)F質(zhì)量濃度越大，電極表面上與FF結(jié)合的抗體分子越多，生成的結(jié)合產(chǎn)物數(shù)量增多，導(dǎo)致電極表面電子的傳遞受到空間阻礙，峰值電流越小。在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，F(xiàn)F質(zhì)量濃度（x）與DPV峰值電流（y）的線性關(guān)系為y=－0.031 1lnx＋1.470 4，R2=0.983 5，檢出限為0.08 ng/mL（RSN=3）。

2.7 樣品加標(biāo)回收率

利用1.3.4節(jié)樣品前處理方法對(duì)豬肉、雞肉、牛肉和雞蛋樣品進(jìn)行處理。FF的加標(biāo)量為10、100、1 000 μg/kg，每組樣品重復(fù)測(cè)定3 次。如表1、2所示，所有樣品的加標(biāo)回收率在76.90%～94.30%之間，說明本方法構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器可以用于肉類和雞蛋中FF殘留的檢測(cè)。

表1 肉類樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 1 Recoveries of FF from spiked meat samples determined by electrochemical immunosensor (n= 3)

表2 雞蛋樣品加標(biāo)回收率（n =3）Table 2 Recoveries of FF from spiked egg samples determined by electrochemical immunosensor (n= 3)

2.8 選擇性和特異性考察結(jié)果

選取FF的3 種結(jié)構(gòu)類似物FFA、TAP以及CAP，考察傳感器對(duì)于這些藥物的DPV響應(yīng)。如圖6所示，當(dāng)在FF標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別添加100 倍質(zhì)量濃度的TAP、CAP以及FFA時(shí)，傳感器的DPV峰值電流從低至高依次為FF、FF＋TAP、FF＋CAP、FF＋FFA。電化學(xué)免疫傳感器在FF標(biāo)準(zhǔn)溶液及3 種干擾物溶液中的峰值電流分別為1.289×10－4、1.307×10－4、1.352×10－4、1.358×10－4A，表明加入干擾物，電流分別增加1.4%、4.9%和5.3%，這說明免疫傳感器具有良好選擇性。如圖7所示，TAP、CAP以及FFA的添加質(zhì)量濃度為FF添加質(zhì)量濃度的100 倍，傳感器的DPV峰值電流大小從低至高依次為FF（1.223×10－4A）、TAP（1.370×10－4A）、CAP（1.394×10－4A）、FFA（1.468×10－4A）；相對(duì)于空白對(duì)照組（1.481×10－4A），電流分別降低17.5%、7.5%、5.9%和0.9%。

圖6 FF電化學(xué)免疫傳感器的選擇性Fig.6 Selectivity of the developed florfenicol immunosensor

圖7 FF電化學(xué)免疫傳感器的特異性Fig.7 Specificity of the developed florfenicol immunosensor

圖8 CAP（A）、TAP（B）、FF（C）和FFA（D）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.8 Chemical structures of chloramphenicol (A), thiamphenicol (B),florfenicol (C) and florfenicol amine (D)

由圖8可知，TAP與FF的結(jié)構(gòu)最為接近，基本基團(tuán)均為分子兩端的甲苯磺?；蛢蓚€(gè)氯原子以及中間位置的酰胺基團(tuán)，因此電流變化值最小，與FF的交叉反應(yīng)率最高；CAP和FF相比，苯環(huán)上的磺?；?yōu)橄趸?，氟原子變?yōu)榱u基，但分子另一端的氯原子和酰胺基團(tuán)不變，因此電流變化值高于TAP，與FF的交叉反應(yīng)率低于TAP；FFA和FF相比，斷開了酰胺鍵，脫去了羰基和氯原子，相對(duì)于TAP和CAP，與FF的結(jié)構(gòu)差異最大，因此電流變化值最大，與FF的交叉反應(yīng)率最高低。

由此可知，圖6中，加入干擾物后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的電流變化值均較小，說明建立的免疫傳感器選擇性良好；圖7中，建立的免疫傳感器對(duì)100 倍質(zhì)量濃度的其他結(jié)構(gòu)類似物的電流變化值較小，說明對(duì)FF的特異性較強(qiáng)。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將制備好的BSA/anti-FF/GR-CS/GCE于4 ℃保存6 d，每隔24 h測(cè)定一次相同電極的DPV峰值電流。峰值電流的變化情況如圖9所示，第6天電極的峰值電流相較于第1天僅下降了11.6%，說明構(gòu)建的傳感器穩(wěn)定性良好。

圖9 FF電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性Fig.9 Stability of the developed florfenicol immunosensor

2.10 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)電化學(xué)方法的驗(yàn)證

2.10.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)實(shí)際樣品

表3 肉類樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 3Recoveries of FF from spiked meat samples determined by LC-MS/MS (n= 3)

配制質(zhì)量濃度梯度為1、10、100、200、300、500、700、1 000 ng/mL的FF標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到FF標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=170.32x＋67 028，R2=0.999 8，檢出限（RSN=3）為1.0 ng/mL。

根據(jù)1.3.4節(jié)方法對(duì)豬肉、雞肉、牛肉和雞蛋樣品（預(yù)先檢測(cè)不含F(xiàn)F）進(jìn)行前處理。FF的加標(biāo)量為10、100、1 000 μg/kg，每組樣品重復(fù)測(cè)定3 次。加標(biāo)回收率結(jié)果如表3、4所示，所有樣品的加標(biāo)回收率在85.60%～101.50%之間，說明前處理方法可行，可以用于動(dòng)物性食品中FF的檢測(cè)。

表4 雞蛋樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 4 Recoveries of FF from spiked egg samples determined by LC-MS/MS (n= 3)

2.10.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與電化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析

圖10 電化學(xué)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果線性回歸分析Fig.10 Good linear correlation between electrochemical and LC-MS/MS results

由圖10可知，電化學(xué)方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法的測(cè)定結(jié)果擬合方程為y=1.080 4x＋2.951 4，R2=0.989 8。因此，本研究建立的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)動(dòng)物性食品中殘留的FF方法準(zhǔn)確可靠，可用于現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的快速檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本研究制備GR-CS復(fù)合修飾材料，利用FF多克隆抗體成功構(gòu)建了一種基于GR的新型電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)動(dòng)物性食品中的FF殘留。在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，F(xiàn)F質(zhì)量濃度與DPV峰值電流呈線性關(guān)系，檢出限為0.08 ng/mL（RSN=3），操作簡便，靈敏度高，選擇性、特異性和穩(wěn)定性均良好，可用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的快速檢測(cè)。