黃永雄 牛金中 楊世平 簡紀(jì)常

摘 要：Galectin-related protein B是一種缺乏半乳糖苷結(jié)合活性的半乳糖凝集素相關(guān)蛋白B?；贜CBI公布的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus） Galectin-related protein B 基因序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)引物，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-GRPB，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，并對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：在28℃條件下，IPTG濃度為0.20mmol/L，誘導(dǎo)6h時(shí)，誘導(dǎo)重組蛋白的效果最佳;經(jīng)Western-blot免疫印跡顯示，純化后的重組蛋白能與帶HIS標(biāo)簽的單抗特異結(jié)合，條帶單一，進(jìn)一步證明該重組蛋白為Galectin-related protein B蛋白。

關(guān)鍵詞：尼羅羅非魚;凝集素相關(guān)蛋白B;原核表達(dá);條件優(yōu)化

中圖分類號(hào) S917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）18-0012-04

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-related Protein B Gene in Nile Tilapia

HUANG Yongxiong et al.

（Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China;Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088，China）

Abstract：Galectin-related protein B is a galactose lectin-related protein B which lacks galactoside binding activity. In this study，primers with restriction site were designed based on the? Galectin-related protein B gene sequence of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）published by NCBI，and the prokaryotic expression vector pET-28a-GRPB，was constructed. The recombinant plasmid was introduced into E. coli to induce the expression of the recombinant plasmid protein. The factors affecting the expression of the protein were optimized. The results showed that the concentration of the recombinant protein reached a maximum under? the induced time of 6h，the induced temperature of 28℃ and concentration of IPTG of 0.20mmol/L. Western-blot blotting showed that the purified recombinant protein could specifically bind to the monoclonal antibody with HIS tag and had a single band，which further proved that the recombinant protein was Galectin-related protein B protein.

Key words：Oreochromis niloticus;Lectin-associated protein B;Prokaryotic expression;Condition optimization

凝集素是一類碳水化合物結(jié)合蛋白，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能在諸如先天免疫、抵御病原體中發(fā)揮作用：識(shí)別，內(nèi)吞，補(bǔ)體激活，抗原加工，B和T細(xì)胞克隆選擇、成熟、激活和凋亡[1]。半乳凝素（Galectins）識(shí)別β-半乳糖的能力及對(duì)凝集素的保守序列2大特征，于20世紀(jì)70年代首次被描述為半乳糖苷結(jié)合凝集素[2]，也被稱為galaptins和S型凝集素[3]。所有半乳糖凝集素共有130個(gè)氨基酸組成的保守碳水化合物識(shí)別域（crd），負(fù)責(zé)碳水化合物的結(jié)合。Galectins參與了多種生物過程，如細(xì)胞粘附[4]、先天免疫[5-6]、細(xì)胞分化與發(fā)育[7]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]，細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的調(diào)控[9]以及前mRNA剪接[10]。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)了許多與galectin家族序列相似的蛋白質(zhì)。然而，由于缺乏半乳糖苷結(jié)合活性，它們被稱為Galectin相關(guān)蛋白（GRPs）[11]。目前，已從魚類物種中鑒定出若干種GRP，包括紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、綠河鲀（Tetraodon nigroviridis）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）等，但硬骨魚類中，僅報(bào)道了條石鯛（Oplegnathus fasciatus）GRP的分子特征和生物學(xué)功能[12]。研究顯示，條石鯛GRP是一種進(jìn)化保守的合成凝集素，與原型半乳糖凝集素密切相關(guān)。Galectin相關(guān)蛋白在條石鯛的鰓和脾臟中的上調(diào)，表明它可能在細(xì)菌和病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。

尼羅羅非魚是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種[13]，但近年來由于受到無乳鏈球菌感染，羅非魚養(yǎng)殖受到沉重打擊，經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前對(duì)于羅非魚免疫系統(tǒng)的研究尚處于起步階段，尤其是凝集素相關(guān)蛋白。因此，本研究基于Galectin-related protein B基因在NCBI上的序列設(shè)計(jì)引物克隆其完整ORF區(qū)并構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化，為后續(xù)羅非魚凝集素相關(guān)蛋白的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)所用尼羅羅非魚購于湛江市東海島養(yǎng)殖場(chǎng);Ex Tap酶、DL2000 DNA Marker、PMD-18載體購于TaKara 生物公司;RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、切膠回收試劑盒及E.coil DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞購自TRANS公司;質(zhì)粒提取試劑盒由Thermo scientific公司提供;原核表達(dá)載體pET-28a（+）載體質(zhì)粒由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 尼羅羅非魚GRPB基因片段的擴(kuò)增及測(cè)序 在超凈工作臺(tái)上剪取羅非魚肝臟組織塊，用組織勻漿器研磨組織塊，按照RNA提取試劑盒說明純化提取RNA。將提取所得RNA用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，條帶單一且具有2條帶以上即可用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)NBCI官網(wǎng)所收錄的羅非魚GRPB基因序列（登錄號(hào)：XM_031733405.1）設(shè)計(jì)克隆引物：GRPB-H-F：CCGGAATTCATGGAAGAAAAGGACAATAAAGAAAATG，GRPB-hisR：CCG CTCGAG A GGCCACCTTGGTAAGCTGTAGA。PCR擴(kuò)增以合成的cDNA為模板，擴(kuò)增體系為：Ex Tap：10μL、4-GRPB-H-F/4-GRPB-hisR：1μL、cDNA：1μL、ddH2O：7μL，共20μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃、5min;95℃、30s;56℃、30s;72℃、25s;30個(gè)循環(huán);結(jié)束后72℃、5min;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳后根據(jù)切膠回收試劑盒說明回收產(chǎn)物。將純化所得DNA片段與PMD-18載體鏈接，16℃連接12h后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗性的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取陽性菌液送往廣州生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建 將測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確的陽性菌液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒PMD-18-GRPB以及pET-28a（+）空載質(zhì)粒，分別用EcoR1和XhoI限制內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒，酶切條件為37℃、10min。將酶切產(chǎn)物凝膠電泳，同樣也使用膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物。用T4連接酶將2種回收產(chǎn)物在4℃條件下連接12h后導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，隨后將感受態(tài)細(xì)胞涂布于含卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取單菌落陽性菌送往生物公司測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo) 將測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確的含重組質(zhì)粒pET-28a-GRPB的單菌落按照1∶100的比例接種于含卡那霉素的液體培養(yǎng)基，在37℃恒溫?fù)u床進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD值在0.4～0.6時(shí)，加入1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)5h，將誘導(dǎo)后菌液離心收集細(xì)菌，水煮法提取誘導(dǎo)蛋白，利用聚丙烯酰氨SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)分析蛋白。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件優(yōu)化（1）IPTG濃度優(yōu)化。分別使用濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白，條件是37℃、5h。收集不同誘導(dǎo)濃度菌液中的細(xì)菌，用PBS緩沖液洗去培養(yǎng)液后加蛋白上樣緩沖液染色，水煮10min，4℃離心收集上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，分析電泳圖。

（2）誘導(dǎo)溫度優(yōu)化。溫度設(shè)置3個(gè)梯度：18、28、37℃，使用1mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h，同上述方法步驟處理收集誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，分析圖譜。

（3）誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化。選取最適IPIG濃度以及誘導(dǎo)溫度，設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間梯度為1、2、3、4、5、6、7h。分別處理不同誘導(dǎo)時(shí)間菌液，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。

（4）重組蛋白表達(dá)形式分析。在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)重組蛋白，離心收集菌液中細(xì)菌，一部分進(jìn)行超聲波粉碎后，離心取上清和沉淀;另一部分提取全菌蛋白;將上清、沉淀以及全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，確定重組蛋白主要表達(dá)形式。

1.2.5 Western blot分析 將純化所得GRPB蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，完畢后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印電流為450mA，35min。用含5%脫脂奶粉的TBS-Tween-20封閉轉(zhuǎn)印好的PDVF膜（4℃、2h）。封閉完成后使用TBST緩沖液洗脫P(yáng)DVF膜，每次洗脫5min，洗脫3次;一抗（含GST標(biāo)簽鼠抗）常溫孵育GRPB蛋白2h，同樣用TBST 洗脫3次;二抗羊抗鼠IgG常溫孵育蛋白1h，TBST緩沖液洗脫3次，用DAB顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 GRPB基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 用羅非魚cDNA模板與特異性引物擴(kuò)增得到一條438bp的條帶（見圖1）。目的片段與PMD-18T載體連接，用PMD-18T載體通用引物M13/RV進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段大小約560bp（圖1），與預(yù)期目標(biāo)一致，說明所挑選的單菌落為陽性克隆菌，GRPB基因克隆及載體構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo) 重組蛋白pET-28a-GRPB在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)大小約為21kD條帶（圖2），與GRPB蛋白預(yù)測(cè)大小一致，未經(jīng)過誘導(dǎo)的重組蛋白則沒有該條帶，而空載pET-28a菌株在誘導(dǎo)前后無差別，說明重組蛋白pET-28a-GRPB表達(dá)成功。

2.3 重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件優(yōu)化 GRPB蛋白表達(dá)量影響后續(xù)的蛋白純化和收集，因此，有必要進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)。由不同濃度IPTG誘導(dǎo)的SDS-PAGE電泳圖可知，在IPTG濃度為0.2mmol/L，重組蛋白的表達(dá)量最大（圖3）;誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度不變時(shí)，誘導(dǎo)溫度在28℃時(shí)蛋白表達(dá)量最多（圖4）;蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增多，誘導(dǎo)6h表達(dá)量達(dá)到最大（圖5）

2.4 GRPB重組蛋白的可溶性分析 分別在18、28、37℃條件下加入0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)GRPB蛋白6h后用超聲波破碎，取上清、沉淀以及全菌跑SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示在最優(yōu)誘導(dǎo)溫度28℃時(shí)，GRPB蛋白以可溶性蛋白為主要表達(dá)形式（見圖6）。

2.5 GRPB重組蛋白的純化及鑒定 通過最優(yōu)誘導(dǎo)條件（IPTG濃度為0.2mmol/L、28℃以及誘導(dǎo)6h），經(jīng)破碎及純化柱純化后跑SDS-PAGE電泳，顯示該蛋白為可溶性蛋白表達(dá)且純化后的條帶單一（圖7）。Western-blot結(jié)果顯示，GRPB重組蛋白能與鼠抗His-Tag單克隆抗體特異性結(jié)合，說明重組蛋白為尼羅羅非魚的Galectin-related protein B蛋白（圖8）。

3 結(jié)論與討論

本研究將羅非魚GRPB基因進(jìn)行克隆及成功構(gòu)建pET-28a-GRPB原核表達(dá)載體，并表達(dá)帶HIS標(biāo)簽蛋白。試驗(yàn)所用菌株為大腸桿菌，該菌株具有快速、簡易、高效誘導(dǎo)表達(dá)等特點(diǎn)[14]，是最為常用的重組蛋白表達(dá)體系。蛋白大量純化時(shí)，蛋白表達(dá)量與溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度有關(guān)[15]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在IPTG濃度為0.2mmol/L，蛋白表達(dá)量最大，誘導(dǎo)濃度大于0.2mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量反而下降，說明過高濃度的IPTG對(duì)大腸桿菌的生長具有抑制作用[16];誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，蛋白表達(dá)量最高，誘導(dǎo)溫度過低或過高均對(duì)蛋白產(chǎn)量產(chǎn)生影響，推測(cè)溫度影響合成蛋白相關(guān)酶的活性[17];誘導(dǎo)時(shí)間以6h最佳。經(jīng)Western blot檢測(cè)純化后蛋白，蛋白能與帶HIS標(biāo)簽單克隆抗體特異結(jié)合且條帶單一，證明該重組蛋白就是Galectin-related protein B。

本試驗(yàn)探究了尼羅羅非魚GRPB基因的最優(yōu)條件誘導(dǎo)原核表達(dá)，實(shí)現(xiàn)GRPB蛋白的大量純化回收，為后續(xù)該基因的抗體制備和蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：徐世紅）