成榮杰， 李 楠

(哈爾濱醫(yī)科大學 附屬第四醫(yī)院 1.婦產科； 2.病理科，黑龍江 哈爾濱150001)

宮頸癌的發(fā)病率位居全球婦女惡性腫瘤的第二位，在我國是女性生殖道最常見的惡性腫瘤，復發(fā)及轉移是威脅患者生命的主要原因。2018年，全球有569847新發(fā)病例，共311,365人死于宮頸癌[1]。手術、放化療是宮頸癌的主要治療手段，但幾十年來患者的長期生存率并未得到顯著改善，晚期患者的總體生存期仍然不足1年。因此，進一步尋找宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關調控因素是非常必要的。巨噬細胞移動抑制因子(MIF)[2]是重要的炎癥反應蛋白，但近年來，MIF與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關系被日益關注[3]。CD74是一種II型跨膜糖蛋白，為MIF高親和力受體，在MHC II類分子進行外源性抗原遞呈的過程中起重要輔助作用，目前，在一些疾病及腫瘤細胞中，發(fā)現(xiàn)MIF通過與CD74受體結合而發(fā)揮作用[4]。這也引發(fā)了我們探尋其與宮頸癌之間潛在的分子機制，以期為多靶點抗腫瘤治療提供新思路。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)[5],MIF與其受體CD74在宮頸癌中高表達，可促進癌組織新生血管形成，表明其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。為進一步了解兩者在宮頸鱗癌中所發(fā)揮的具體作用，本文通過體外細胞實驗來明確MIF及CD74對宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲等生物學行為的影響，明確兩者在宮頸癌病理發(fā)生發(fā)展中的作用機制，從而為宮頸癌靶向分子治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸鱗癌細胞株SiHa購于上海生命科學研究院，接種于含10%胎牛血清的H-DMEM中，置于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代。兔抗MIF及鼠抗CD74抗體購于美國Santa Cruz公司；人重組MIF因子(rhMIF)購于R&D公司；Matrigel購于美國BD 公司；CCK8試劑盒購于美國Invitrogen 公司；Tranwell 小 室 購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1免疫細胞化學染色法檢測SiHa細胞中MIF及CD74蛋白表達 將SiHa細胞經胰酶消化后接種于24孔培養(yǎng)板內預先放置的蓋玻片上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞80%融合時，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后取出細胞爬片，經蒸餾水水化、0.1% Triton X-100作用、熱修復、過氧化物酶阻斷液室溫孵育后，血清封閉，進行一抗孵育(1∶100稀釋抗MIF或CD74抗體)，4℃過夜，加生物素標記二抗等，最后DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。Image pro-plus 6.0軟件分析，平均灰度值代表MIF和CD74蛋白表達情況。

1.2.2CCK-8法檢測細胞的增殖情況 胰酶消化SiHa細胞，調整細胞密度5×104/mL，100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板、孵育24 h。給予不同濃度rhMIF(1，10，50，100及200 ng/mL)處理細胞，24 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個濃度設3個復孔，連續(xù)觀察3天。每24 h取一塊培養(yǎng)板，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育2 h后測定450 nm吸光度值(OD)。

通過上述實驗篩選出加藥后24 h使細胞增殖與對照組相比差異具有統(tǒng)計意義的最小有效rhMIF濃度用于后續(xù)實驗。實驗分為3組：MIF組、MIF+CD74mAb(10 μg/ml)組及MIF+對照IgG(10 μg/ml)組。觀察應用抗CD74mAb后對細胞增殖的影響，細胞增殖抑制率的計算公式：(MIF組OD值-MIF+CD74mAb組OD值)/ MIF組OD值×100%。

1.2.3劃痕法檢測體外遷移能力 胰酶消化收集細胞，調整細胞濃度為2×105/mL，將其接種于24孔培養(yǎng)板，500 μl/孔。實驗分組：① rhMIF刺激組(200 ng/mL)；② rhMIF+CD74mAb組：細胞預先與CD74mAb孵育30 min，再加入rhMIF；③rhMIF+對照IgG組：含10 μg/mL的IgG抗體及200 ng/ml的rhMIF；④陰性對照組。待細胞單層融合，移液器槍頭在培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，無血清培養(yǎng)液洗滌以除去懸浮細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于劃痕后0 h及24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞的遷移情況并照相。測量劃痕后0 h的距離(A值)及24 h劃痕區(qū)的距離(B值)，計算細胞相對移動距離=(A-B)/A×100。

1.2.4Transwell小室檢測SiHa細胞的侵襲力 實驗分組同上。Matrigel膠在4℃條件下融化，與無血清培養(yǎng)基按1∶3比例混勻，60 μl/孔加于小室的上室膜上，37℃作用30 min。細胞經無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，胰酶消化細胞，調整細胞密度為1×106/mL，24孔板內加入300 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基，小室內加入100 μl細胞懸液(細胞置于含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)24 h。取出小室，棉簽擦去聚碳酸酯膜上層未穿膜的細胞，95%乙醇固定，HE染色，顯微鏡下計數移至微孔膜下層的細胞。每個樣本計數5個視野，結果用mean±SD表示。

1.2.5統(tǒng)計學分析 所有數據處理采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數據以mean±SD表示，兩組間比較采用t檢驗；多組比較采用重復測量的One-Way ANOVA方差分析。以P<0.05為統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫細胞化學染色顯示宮頸SiHa細胞高表達MIF及CD74蛋白

在宮頸SiHa細胞中，MIF和CD74陽性染色主要位于細胞的胞漿內、為棕黃色的顆粒。如圖1所示，圖1A顯示MIF在SiHa細胞中的染色結果，主要定位于細胞漿，偶可見核著色； 圖1B為CD74分子的陽性染色，其同樣主要定位于細胞漿。

2.2 外源性MIF及抗-CD74mAb調控了SiHa細胞的增殖力

應用不同濃度的rhMIF處理各組細胞后，細胞的增殖情況見圖2。如圖2A所示：在刺激后24 h、48 h及72 h，隨著MIF濃度的逐漸增加，細胞增殖力亦增強(OD值逐漸增加，24 h:F=12.125，P<0.001；48 h:F=25.147，P<0.001；72 h：F=95.812，P<0.001)；且隨刺激時間的延長，細胞的增殖率逐漸增加。即rhMIF呈時間-劑量依賴性促進SiHa細胞的增殖。

圖1 MIF及CD74在SiHa細胞中的表達(×400)

為明確CD74是否參與MIF對宮頸癌細胞的增殖調控過程，我們進行了分組實驗，結果表明(如圖2B)，與單純MIF刺激組相比，抗-CD74mAb預先處理的細胞，其增殖受抑制，提示CD74參與MIF對細胞增殖的調控。

圖2A：rhMIF促進SiHa細胞增殖； B：抗-CD74mAb抑制了MIF促細胞的增殖能力

2.3 MIF對SiHa細胞遷移力的影響

細胞劃痕法顯示(表1)，200 ng/ml的MIF刺激24 h后，細胞遷移力較對照組相比明顯增加(P<0.01),而當細胞與抗-CD74mAb孵育后，并不能阻斷MIF對細胞遷移力的促進作用(P>0.05)。結果表明，MIF具有促進SiHa細胞遷移力的作用，但不是通過CD74實現(xiàn)的。

表1 MIF與CD74mAb對各處理組細胞遷移率的影響

2.4 MIF增加了SiHa細胞的侵襲力

為評估MIF對SiHa細胞的侵襲力是否有影響，利用transwell小室檢測各處理組細胞穿膜的細胞數量。結果如圖3及表2所示，rhMIF作用24 h后，穿膜細胞的數量與對照組相比明顯增加(P<0.01)；而抗-CD74mAb或IgG預處理的細胞與單純MIF刺激組相比，差異無統(tǒng)計學意義。以上結果表明MIF可增加宮頸癌細胞侵襲轉移力，但這種作用可能與CD74蛋白無關。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多因素參與的復雜過程，涉及細胞的惡性轉化、無限增殖、細胞間粘附力下降及浸潤周圍組織或進入脈管系統(tǒng)，形成浸潤轉移灶。因此，探尋這個復雜過程中的相關調控因素，對于阻斷宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，從而改善患者的預后具有重要的臨床意義。MIF最初是在活化的T淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的，具有酶活性、參與淋巴免疫、內分泌調控及促炎作用等多種生物學功能，單核/巨噬細胞是其主要來源。Meyer-Siegle等[6]在對前列腺癌原發(fā)及轉移灶進行基因差異表達分析時發(fā)現(xiàn)MIF在轉移灶內表達上調，這是關于MIF與腫瘤間存在關聯(lián)的首次報道。此后，研究者們發(fā)現(xiàn)MIF的其他生物學功能，如促增殖分化、調控血管生成、抑制p53基因等，由此，MIF與腫瘤關系的研究日益增多。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤中觀察到MIF的過度表達，如前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等[3,7,8]，提示其參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CD74作為MIF高親和力受體，隨著對MIF研究的逐漸深入，CD74的功能也備受關注，除在免疫反應中發(fā)揮作用，亦在多種癌細胞中發(fā)現(xiàn)CD74的過表達[9,10]，Nagata等[11]研究發(fā)現(xiàn)CD74是評價胰腺癌患者預后的一個有用的指標。McClelland等[12]對肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，MIF和CD74的表達與血管趨化因子的表達及MVD呈正相關，MIF所誘導的CXC的表達可被抗CD74抗體所阻斷；在結腸癌中亦發(fā)現(xiàn)了MIF/CD74的共同作用[13]。而有關MIF及CD74在宮頸癌中的研究報道很少，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)了宮頸癌組織中兩者的過度表達，MIF可通過調控促血管生成因子的表達，促進惡性腫瘤的血管新生，對腫瘤的生長及侵襲轉移發(fā)揮作用。那么，兩者是否對宮頸癌的增殖、遷移及侵襲等生物特性有調節(jié)作用，成為我們的研究目標。在本文中，我們采用一系列實驗評價MIF及其受體CD74對宮頸癌細胞株生物學行為的影響，探索其參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的可能機制。本研究應用rhMIF處理宮頸癌SiHa細胞，結果顯示MIF可促進細胞增殖，且呈時間-劑量依賴性，這與其他研究結果一致[14]。當抗CD74單抗處理細胞后，可顯著抑制MIF對細胞增殖的促進作用，表明兩者共同參與調控宮頸鱗癌細胞的增殖能力。

圖3 MIF與CD74mAb對SiHa各處理組細胞侵襲力的影響(×100)

表2 MIF和抗-CD74mAb對各處理組SiHa細胞侵襲力的影響

細胞外基質及基底膜的降解是腫瘤侵襲轉移的必要步驟，Koh等[7]通過傷口愈合實驗發(fā)現(xiàn)，MIF基因敲除可導致癌細胞遷移減少，提示MIF與腫瘤進展密切相關。本實驗通過細胞劃痕法及transwell小室法分別檢測MIF對SiHa細胞遷移力及侵襲力的影響，結果顯示200 ng/ml rhMIF可顯著促進SiHa細胞遷移及侵襲力，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義；但細胞經CD74單抗預處理后，沒能阻斷或抑制MIF促癌細胞的遷移侵襲力，提示MIF可能通過其他受體作用途徑來調控其促進宮頸癌細胞的浸潤轉移力。以上結果證明MIF調控了宮頸癌的增殖，遷移及侵襲等生物學行為，CD74參與了MIF對細胞增殖的調控作用，從而在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，而此過程中涉及具體的分子機制是我們將來進一步的研究方向。期望能為尋求宮頸癌的治療新靶點提供思路，從而提高病人的生存率。