黎壯偉， 張廣麗

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520

肺癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤發(fā)病率的首位，化療是肺癌的主要治療手段之一，但化療會引起骨髓抑制等副作用，嚴重者可導(dǎo)致化療終止，影響后續(xù)的治療?；熞鸬墓撬柙煅δ軗p傷也是影響患者生存質(zhì)量和治療效果的重要因素。因此，尋找有效藥物來減輕化療對骨髓抑制，修復(fù)化療對骨髓造血微環(huán)境損傷，成為目前研究的重點。龜板固本方在臨床上治療骨髓抑制具有良好的療效[1，2]，但其機制不詳，本研究從骨髓造血微環(huán)境損傷修復(fù)的角度研究龜板固本方治療肺癌化療骨髓損傷的療效及其機制，為龜板固本方改善骨髓造血功能提供科學(xué)依據(jù)，探索治療肺癌化療致骨髓抑制的有效處方。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞株 C57BL/6 小鼠購于北京華阜康科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證SCXK（京）2019-0008]，重量18 g～22 g，SPF 級。動物分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫（21 ± 2）℃，濕度30%～60%。Lewis 肺癌瘤株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥物 龜板固本方由龜板、黃精、桑椹、黃芪、紅參等組成，中藥飲片從廣州致信藥業(yè)股份有限公司購買，按常規(guī)方法水煎取汁濃縮而成，實驗用藥生藥含量為0.8 g/mL。重組人粒細胞刺激因子注射液，規(guī)格75 μg/支，杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn)，國藥準字S10980029。注射用環(huán)磷酰胺由江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.2 g/瓶，國藥準字H32020857。

1.3 主要試劑和儀器 IMDM培養(yǎng)液購自HYCLONE公司，批號：NWB0372；重組小鼠粒單系集落刺激因子購自美國Peprotech 公司，批號：050755-1；重組白細胞介素-3購自美國Peprotech公司，批號：120948；重組人促紅細胞生成素購自美國Peprotech 公司，批號：P9BM0042。Napco-5410 CO2培養(yǎng)箱（美國Shelden 公司）；全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（YXQ－LS－SⅡ）；UV2101 PC 型紫外分光光度計（尤尼科上海儀器有限公司）。熒光顯微鏡（Leica Microsystems Ltd，德國），自動血細胞分析儀（日本Sysmex-820）。TPO Elisa 試劑、EPO Elisa 試劑和GM-CSF 試劑均購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法

2.1 動物分組與給藥

將60 只Lewis 肺癌小鼠隨機分為4 組，空白組、模型組、龜板固本方組、西藥組，每組15只。除空白組外，其他3組均進行造模。小鼠造模完成后24 h 開始給藥，龜板固本方組每只小鼠按0.4 ml/d 的劑量灌胃給藥；空白對照組和模型組給等量生理鹽水；西藥組皮下注射重組人粒細胞刺激因子注射液5 ng/g，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

2.2 建立Lewis肺癌小鼠化療致骨髓抑制模型

取對數(shù)生長期的Lewis 肺癌細胞，常規(guī)離心，制成瘤細胞混懸液，消毒小鼠右前腋，取0.2 ml接種于皮下。待瘤體生長至直徑1～1.5 cm 時，處死小鼠，選取生長良好的瘤組織，剪碎、稱重，用細胞勻漿器制成勻漿，制備成濃度為1×107/ml 瘤細胞混懸液，每只小鼠右腋下接種0.2 ml（約1～2×106瘤細胞），接種4 d 后，以小鼠右腋下皮下可觸及腫瘤塊標志造模成功，建立Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型。上述Lewis肺癌荷瘤模型小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺250 mg/kg（于臨用前配制），以外周血細胞（WBC、RBC、PLT）明顯低于正常小鼠（均P＜0.05），提示模型復(fù)制成功，完成Lewis 肺癌荷瘤小鼠化療致骨髓抑制模型[3]。

2.3 觀察指標

2.3.1 外周血象檢測

每組小鼠分別于造模后（0 d）及給藥7 d 后（造模后8 d）尾靜脈采血，用自動血細胞分析儀進行血常規(guī)檢測。

2.3.2 骨髓造血微環(huán)境檢測

小鼠給藥7 天后，經(jīng)頸椎脫臼處死，取股骨，用剪刀剪開股骨兩頭，露出骨髓腔，然后用消毒過的注射器、4 號針頭，吸取2 ml培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，全部置離心管內(nèi)，反復(fù)吹打使細胞完全分散，然后離心10 min（1 000 r/min），去上清，加入適量培養(yǎng)液充分混勻，制成骨髓有核細胞懸液，臺盼藍鑒定細胞活性在95%以上。提取骨髓有核細胞懸液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ABC-ELISA）檢測骨髓有核細胞懸液上清中的紅細胞生成素（EPO），血小板生成素（TPO），粒細胞集落刺激因子（G-CSF）含量，具體按試劑盒說明書操作。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

將所得結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，多組均數(shù)比較用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龜板固本方對肺癌骨髓抑制小鼠外周血象的影響

在造模后當(dāng)天（0 d），模型組、龜板固本方組、西藥組的小鼠外周血白細胞（WBC）下降，均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），模型組、龜板固本方組與西藥組的小鼠外周血WBC 組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明造模成功。用藥干預(yù)7 d后，龜板固本方組的WBC明顯高于干預(yù)前（0 d）（P＜0.05），也高于模型組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示龜板固本方能顯著提升骨髓抑制小鼠的外周血白細胞。西藥組WBC 明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這跟西藥組使用粒細胞刺激因子注射液有關(guān)，見表1。

表1 龜板固本方對骨髓抑制小鼠外周血白細胞的影響（±s，×109/L）

表1 龜板固本方對骨髓抑制小鼠外周血白細胞的影響（±s，×109/L）

注：造模后0 d，與空白組比較，①P＜0.01；造模后8 d，與模型組比較，②P＜0.05；與西藥組比較，③P＜0.01；龜板固本方干預(yù)前后比較，④P＜0.05。

造模后8 d 6.54±1.25③2.34±0.78③3.92±0.64②③④17.8±3.95分組空白組模型組龜板固本方西藥組例數(shù)15 15 15 15造模后0 d 6.84±1.23 2.11±0.86①2.14±0.63①2.30±0.52①

在造模后當(dāng)天（0 d），模型組、龜板固本方組、西藥組的小鼠外周血血小板（PLT）下降，均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組、龜板固本方組與西藥組的外周血PLT 組間比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功。用藥干預(yù)7 d后，龜板固本方組的血小板明顯高于模型組（P＜0.01），與干預(yù)前比較，龜板固本方干預(yù)后，小鼠外周血血小板明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示龜板固本方能顯著提升骨髓抑制小鼠的外周血血小板，見表2。

表2 龜板固本方對骨髓抑制小鼠外周血血小板的影響（±s，×109/L）

表2 龜板固本方對骨髓抑制小鼠外周血血小板的影響（±s，×109/L）

注：造模后0 d，與空白組比較，①P＜0.01；造模后8 d，與模型組比較，②P＜0.01；龜板固本方干預(yù)前后比較，③P＜0.01。

造模后8 d 分組 例數(shù) 造模后0 d 653.60±86.71 209.60±41.10 390.13±72.04②③337.40±50.16空白組模型組龜板固本方西藥組15 15 15 15 652.53±85.43 252.93±63.97①268.20±56.64①237.47±30.76①

在造模后當(dāng)天（0 d），模型組、龜板固本方組、西藥組的小鼠外周血紅細胞（RBC）下降，均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），模型組、龜板固本方組與西藥組的外周血RBC 組間比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功。用藥干預(yù)7 d后，龜板固本方組的RBC明顯高于模型組（P＜0.01）；與干預(yù)前比較，龜板固本方干預(yù)后，小鼠紅細胞升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示龜板固本方能顯著提升骨髓抑制小鼠的外周血紅細胞，見表3。

表3 龜板固本方對骨髓抑制小鼠外周血紅細胞的影響（±s，×1012/L）

表3 龜板固本方對骨髓抑制小鼠外周血紅細胞的影響（±s，×1012/L）

注：造模后0 d，與空白組比較，①P＜0.01；造模后8 d，與模型組比較，②P＜0.01；龜板固本方干預(yù)前后比較，③P＜0.05。

造模后8 d 9.88±0.99 5.13±0.74 6.35±1.33②③4.98±0.90分組空白組模型組龜板固本方西藥組例數(shù)15 15 15 15造模后0 d 10.16±1.84 5.72±1.24①5.07±1.23①5.15±2.49①

3.2 龜板固本方對肺癌骨髓造血微環(huán)境細胞因子GM-CSF、EPO和TPO的影響

用藥干預(yù)7 d后，與空白組相比，模型組、龜板固本方組和西藥組的GM-CSF 及EPO 含量明顯減少（P＜0.01），TPO 明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，龜板固本方能明顯提高GM-CSF、EPO及TPO含量（P＜0.01），降低TPO含量（P＜0.01）。

表4 龜板固本方對骨髓抑制小鼠骨髓造血細胞因子G-CSF、EPO和TPO的影響（±s）

表4 龜板固本方對骨髓抑制小鼠骨髓造血細胞因子G-CSF、EPO和TPO的影響（±s）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01。

分組空白組模型組龜板固本方西藥組TPO 28.60±9.12 159.67±30.32①61.93±14.73①②53.53±6.93①例數(shù)15 15 15 15 G-CSF 209.00±29.15 120.73±23.77①144.33±29.72①146.87±44.99①EPO 75.40±8.93 43.53±13.22①62.07±11.98①②47.40±17.59①

4 討論

機體正常的造血活動依賴于造血干細胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）和支持造血干細胞生長發(fā)育的骨髓微環(huán)境的相互作用。骨髓微環(huán)境是指造血干細胞能維持自身細胞系特征的特殊環(huán)境組成的組織區(qū)域，是造血干細胞賴以生存，進行自我更新，并能產(chǎn)生大量祖細胞的內(nèi)環(huán)境。它包括微血管系統(tǒng)、基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)和多種細胞因子[4]。骨髓微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于造血細胞的自我更新及快速增殖至關(guān)重要[5]。造血干細胞能保持自我更新與多向分化增殖能力，與骨髓微環(huán)境細胞因子調(diào)控分不開。造血微環(huán)境是造血干細胞賴于生存的基礎(chǔ)，與造血生成調(diào)控密切相關(guān)。造血干細胞在骨髓微環(huán)境各種因素的調(diào)控下增殖、分化、發(fā)育及成熟。特別是促紅細胞生成素（EPO），血小板生成素（TPO）和粒細胞集落刺激因子（G-CSF）是造血微環(huán)境中重要的造血調(diào)控細胞因子，參與調(diào)控骨髓造血祖細胞的增殖、分化和成熟。EPO 是調(diào)節(jié)紅系生成的主要細胞因子，主要調(diào)控紅系造血干細胞的增殖、分化和成熟；TPO主要促進巨核系祖細胞增殖，促進巨核細胞增殖與分化成熟，以及血小板的成熟和釋放；G-CSF 能選擇性和特異性地刺激造血干細胞向中性粒細胞的定向增殖和分化，動員造血干細胞進入外周血，并可加速粒細胞成熟。研究骨髓微環(huán)境細胞因子對造血細胞生長及細胞系維持具有重要意義。

中醫(yī)理論認為，脾為后天之本，是氣血生化之源，脾虛則血生化無源；腎為先天之本，藏精主髓生血，腎虛則髓海不足而血不能化。若脾腎虧虛，則氣血生成不足?；熕碌墓撬枰种?，可歸為中醫(yī)“虛勞”范疇，其基本病機為脾腎虧虛，精虧髓損。對于化療所致骨髓抑制的治療原則以健脾益腎法為主。研究表明，中醫(yī)健脾補腎法能夠改善骨髓造血功能，具有較好的生血作用，能有效調(diào)節(jié)血清中TPO、EPO、GM-CSF 的表達，從而促進骨髓抑制小鼠造血功能的恢復(fù)[6-9]；還能明顯改善肺癌化療者骨髓造血功能，提高外周血白細胞總數(shù)、中性粒細胞、紅細胞、血紅蛋白及血小板等。因此，從健脾補腎，填精益髓的治法入手來研究骨髓抑制的治療，具有較好的中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)、臨床基礎(chǔ)和實驗基礎(chǔ)的支持。

龜板固本方是本研究課題組治療腫瘤相關(guān)性貧血的有效經(jīng)驗方，主要藥物由龜板、黃精、桑椹、黃芪、紅參等組成，方中龜板性味甘咸，歸腎經(jīng)，為血肉有情之品，峻補精髓，補腎養(yǎng)陰；黃精性味甘平，歸脾腎經(jīng)，滋腎補脾益氣；桑椹子味甘，歸肝腎經(jīng)，滋陰補血，有滋補肝腎及補血之效；黃芪性甘，微溫，歸脾肺經(jīng)，補中益氣，補氣以生血；紅參味甘、微苦，性溫，能大補元氣，益血生津。諸藥合用，具有健脾補腎，填精益髓的功效，切中骨髓抑制的中醫(yī)發(fā)病機理。在本課題組臨床研究中，利用龜板固本方治療相關(guān)性貧血進行臨床觀察，研究結(jié)果表明，龜板固本方治療腫瘤相關(guān)性貧血，能夠提高外周血象中血紅蛋白、紅細胞計數(shù)及紅細胞比容，療效顯著（P ＜0.05）[1]。進一步研究結(jié)果表明，龜板固本方對肺癌化療引起的骨髓抑制有較好的拮抗作用，減輕化療患者外周血象中白細胞、血紅蛋白及血小板的下降，與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），化療患者口服龜板固本方治療后，生存質(zhì)量卡氏評分明顯提高，療效優(yōu)于對照組（P＜0.05）[2]。龜板固本方改善腫瘤相關(guān)性貧血及拮抗化療引起的骨髓抑制具有較好的療效。

采用環(huán)磷酰胺腹腔注射是制備小鼠骨髓抑制模型的成熟方法，造模成功后，小鼠外周血細胞下降[3，7，9，10]。本實驗結(jié)果表明，小鼠骨髓抑制造模后，外周血WBC、RBC 和PLT 均明顯下降，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），說明造模成功。經(jīng)過龜板固本方干預(yù)7 d后，骨髓抑制小鼠外周血常規(guī)的WBC、RBC、PLT 明顯升高，與干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01或P ＜0.05）。與模型組比較，龜板固本方組小鼠外周血常規(guī)的WBC、RBC、PLT 明顯升高，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。進一步研究表明，經(jīng)過龜板固本方干預(yù)后，龜板固本方組骨髓抑制小鼠骨髓微環(huán)境促紅細胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）和粒細胞集落刺激因子（G-CSF）含量上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。這些研究結(jié)果說明龜板固本方具有減輕骨髓抑制和促進骨髓造血的功能。龜板固本方治療肺癌化療后骨髓抑制的機理除了切合骨髓抑制的中醫(yī)病機以外，初步認為其機制可能是通過以下途徑實現(xiàn)的：龜板固本方通過調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的造血因子，通過提升造血因子的含量，修復(fù)骨髓造血微環(huán)境損傷，保護造血干細胞的作用，從而促進骨髓造血機能修復(fù)，達到提升外周血中三系細胞，減輕化療藥物的副作用。但由于機體造血機制十分復(fù)雜，涉及造血干細胞自我擴增、造血微環(huán)境、免疫功能和多個造血調(diào)控通路等，究竟龜板固本方是否通過其他途徑改善骨髓造血功能，仍需進一步深入研究。