肖 嵐,何 蓮,安潘宇,李 娟,鮮丹丹,楊 瑤,杜雙巧

(1.四川旅游學(xué)院食品學(xué)院,四川成都 610100;2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院,四川成都 610000)

壇子肉是四川安岳地區(qū)的一種特色發(fā)酵肉制品,是將豬五花肉經(jīng)油炸之后拌入香辛料,一層蘿卜絲一層肉入壇發(fā)酵而成,因入陶壇發(fā)酵而成,故名壇子肉。由于壇子肉是在自然條件下發(fā)酵,發(fā)酵所需的微生物主要來(lái)自入壇的蘿卜絲所攜帶的野生菌株,因此氣候條件、發(fā)酵時(shí)間、蘿卜絲的初始微生物群落結(jié)構(gòu)、壇子肉以及蘿卜絲本身的化學(xué)組成等都可能影響壇子肉的微生物種群分布、菌落演替、結(jié)構(gòu)組成;而不同種類(lèi)的微生物對(duì)壇子肉的色、香、味甚至安全性等都有較大影響,故研究壇子肉中微生物群落結(jié)構(gòu)可調(diào)控和提升其產(chǎn)品質(zhì)量。

在發(fā)酵肉制品領(lǐng)域,國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要是對(duì)發(fā)酵火腿[1-4]、發(fā)酵香腸[5-6]、發(fā)酵臘肉[7]、發(fā)酵魚(yú)[8-9]等的微生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)解析,甚至研發(fā)出專(zhuān)用發(fā)酵劑,關(guān)于安岳壇子肉發(fā)酵過(guò)程中微生物的演替規(guī)律和多樣性分析的報(bào)道較少。安岳壇子肉仍采用手工作坊式生產(chǎn),依靠自然發(fā)酵,故存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題,因此,本文基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)壇子肉、蘿卜絲中細(xì)菌的16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序,以期獲得壇子肉中細(xì)菌的物種構(gòu)成以及不同發(fā)酵時(shí)間樣品之間的差異關(guān)系,為壇子肉的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬五花肉 四川三元雜交內(nèi)江豬,屠宰后未排酸成熟,備用;白蘿卜絲 水分含量20%,市購(gòu);糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit) 上海哈研生物科技有限公司;MiSeq Reagent Kit V3 美國(guó)Illumina公司;DNA提取試劑盒 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit。

Illumina Miseq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 壇子肉的制備 根據(jù)四川安岳縣普州壇子肉食品有限公司提供的工藝參數(shù),壇子肉及蘿卜絲制備的流程如下:

壇子肉加工工藝流程如下:豬五花肉(采用五花肉作為原料,切配成500 g左右的長(zhǎng)條狀)→晾干表面水分(自然晾干,冬季風(fēng)干2～4 h,肉塊表面干爽為止)→油炸(采用豬油進(jìn)行油炸,油溫160～180 ℃,油炸5～8 min,表面微黃即可)→腌制碼味(將濾過(guò)油的肉均勻涂抹上食鹽、白酒以及香辛料,放置2～3 h即可入壇腌制發(fā)酵)→入壇發(fā)酵75 d(一層蘿卜絲一層肉的方式入燒制的土壇中厭氧發(fā)酵,水封隔絕空氣)。

蘿卜絲的處理:以外購(gòu)水分含量約20%左右的白蘿卜絲為原料,加入5%的食鹽入壇密封腌制3 d,出壇后即為腌制蘿卜絲;將腌制蘿卜絲與入壇發(fā)酵75 d蘿卜絲混合均勻(1∶1質(zhì)量比),即得到混合蘿卜絲。一層蘿卜絲一層肉的方式(混合蘿卜絲與肉一起入壇)入壇厭氧發(fā)酵75 d,即入壇發(fā)酵75 d蘿卜絲。

取樣:分別在入壇發(fā)酵20、40、60、75 d進(jìn)行取樣,壇子肉和蘿卜絲各200 g左右,經(jīng)真空包裝后保存于-80 ℃,備用。

1.2.2 DNA提取和測(cè)序 采用 DNA 提取試劑盒提取不同發(fā)酵時(shí)間(20、40、60、75 d)的壇子肉和蘿卜絲樣品中的微生物總DNA,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度,同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。

擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是16S rDNA基因的V3-V4區(qū)域,通用引物序列為[10]:338F ACTCCTACGGGAGGCA GCAG,806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴(kuò)增結(jié)束后,利用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增效果,并采用AMPure XT beads試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收。

采用Qubit對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量并建立文庫(kù),合格文庫(kù)的濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。將合格的各上機(jī)測(cè)序文庫(kù)(Index序列不可重復(fù))進(jìn)行梯度稀釋,并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由于序列數(shù)量龐大,首先需要根據(jù)barcode信息對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分;利用overlap對(duì)雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過(guò)濾,獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)最終獲得有效數(shù)據(jù)進(jìn)行97%的相似度聚類(lèi),為了降低假陽(yáng)性率,會(huì)過(guò)濾singleton序列,獲得最終的OTU豐度及代表序列,進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、物種分類(lèi)注釋和差異分析等。不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉和蘿卜絲均采集3個(gè)平行樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇子肉和蘿卜絲樣品的微生物Alpha多樣性分析

Alpha多樣性[11](Alpha diversity)是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性,主要用于反映物種豐富度、均勻度以及測(cè)序深度。對(duì)測(cè)序進(jìn)行拼接、過(guò)濾,8組樣品獲得有效序列數(shù)平均為27563條,按照97%的序列相似度將這些序列聚類(lèi)成為OTUs(Operational Taxonomic Units)[12],得到每個(gè)cluster的序列及其代表序列即為OTU,用于統(tǒng)計(jì)每個(gè)OTU序列和豐度進(jìn)行下游分析。發(fā)酵20 d壇子肉平均OTU數(shù)量687、40 d壇子肉654、60 d壇子肉814、75 d壇子肉507;發(fā)酵20 d蘿卜絲平均OTU數(shù)量380、40 d蘿卜絲431、60 d蘿卜絲872、75 d蘿卜絲452。

圖1為不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉和蘿卜絲的等級(jí)豐度圖(rank abundance curve),用來(lái)展示不同樣品(即用不同曲線表示)的菌群相對(duì)豐度和均勻度。由圖1可知,所有曲線在橫軸的范圍均較大,即所有樣品的菌群數(shù)量(被排序的OTU數(shù)量)均較多,菌群的豐富度均較高;在垂直方向,所有曲線的梯度均較陡峭,說(shuō)明所有樣品的菌群種類(lèi)分布不均勻。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間壇子肉和蘿卜絲的等級(jí)豐度圖

不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉以及蘿卜絲樣品的Alpha多樣性指數(shù)見(jiàn)表1,各樣品的菌群覆蓋度指數(shù)(Goods coverage)均能達(dá)到98%以上,表明本次測(cè)序相對(duì)于整體樣品的覆蓋程度是非常高的。Chao1指數(shù)用于估計(jì)樣品中所含OTU數(shù)目。按照發(fā)酵時(shí)間先后,壇子肉的平均Chao1指數(shù)分別為491.84、466.93、596.35和390.03,蘿卜絲的平均Chao1指數(shù)分別為254.57、338.36、585.05和311.92。結(jié)果提示,60 d壇子肉及蘿卜絲的中所含OTU數(shù)目最高。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間壇子肉和蘿卜絲的生物群落豐富度和多樣性指數(shù)(n=3)

observed species指數(shù)表示該樣品中含有的物種數(shù)目。按照發(fā)酵時(shí)間先后,壇子肉的平均observed species指數(shù)分別為258.67、237.00、412.33和390.03,蘿卜絲的平均 observed species指數(shù)分別為138.33、154.67、345.33和124.67。結(jié)果提示,60 d壇子肉和蘿卜絲中含有的物種數(shù)目最高。Simpson指數(shù)越高,意味著樣品物種多樣性越高。Shannon指數(shù)越高反映 OTU 出現(xiàn)的紊亂和不確定性越高。60 d發(fā)酵的壇子肉及蘿卜絲的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均最高。綜上,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),蘿卜絲與壇子肉中的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性增加,特別是壇子肉中細(xì)菌菌群豐富度和多樣性增加較快,這可能與蘿卜絲隨壇子肉入壇加速發(fā)酵進(jìn)程[13-14]有關(guān)。然而,發(fā)酵75 d壇子肉中的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性迅速下降,可能是優(yōu)勢(shì)菌群的大量繁殖抑制雜菌的生長(zhǎng),并導(dǎo)致壇子肉及蘿卜絲pH下降從而進(jìn)一步抑制雜菌的生長(zhǎng)。

2.2 壇子肉和蘿卜絲樣品中物種群落結(jié)構(gòu)差異的比較

Beta多樣性主要用于研究不同樣品之間的物種群落結(jié)構(gòu)差異,而Alpha多樣性只是用來(lái)描述單個(gè)樣品的物種多樣性。為比較不同發(fā)酵時(shí)間樣品的細(xì)菌群落相似性,采用Beta多樣性分析中常用的主成分分析法(PCA,Principal Component Analysis)和算術(shù)平均數(shù)無(wú)權(quán)重對(duì)組法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean,UPGMA)進(jìn)行比較分析,如果樣品間的細(xì)菌群落組成越相似,則它們?cè)赑CA圖、UPGMA 層次聚類(lèi)分析圖中的距離越接近[15]。UPGMA層次聚類(lèi)分析包括unweighted unifrac和weighted unifrac兩種算法,其中unweighted unifrac計(jì)算樣品之間距離時(shí)更側(cè)重描述由群落構(gòu)成差別而導(dǎo)致的樣品間的差異,weighted unifrac計(jì)算樣品之間距離時(shí)更側(cè)重于描述由群落物種豐度梯度改變而導(dǎo)致的樣品間的差異。

如圖2所示,不同分支代表不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉和蘿卜絲,其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異。20 d壇子肉與20 d 蘿卜絲、40 d壇子肉與40 d蘿卜絲分別位于兩個(gè)不同的分支,說(shuō)明發(fā)酵初期(發(fā)酵過(guò)程的前半段,即發(fā)酵前 40 d)的壇子肉和蘿卜絲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異較大。60 d壇子肉與60 d蘿卜絲、75 d壇子肉與75 d蘿卜絲分別位于同一分支,說(shuō)明發(fā)酵后期(發(fā)酵過(guò)程的后半段,即發(fā)酵40～75 d)的壇子肉和蘿卜絲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為接近。這是因?yàn)樘}卜絲入壇時(shí)攜帶大量微生物菌群,而壇子肉在入壇前經(jīng)過(guò)高溫油炸,表面微生物幾乎殺死,蘿卜絲隨壇子肉一起入壇發(fā)酵,壇子肉為蘿卜絲中的微生物提供碳源、氮源從而促進(jìn)其大量繁殖,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),壇內(nèi)微生物趨于平衡,因此壇子肉和蘿卜絲在發(fā)酵前期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異較大,發(fā)酵后期的差異較小。

圖2 UPGMA層次聚類(lèi)分析

另外,75 d壇子肉的3個(gè)平行樣品中有1個(gè)樣品離散在群體之外,提示這個(gè)樣品與其他2個(gè)樣品的相似性不高,可能與發(fā)酵過(guò)程中的開(kāi)壇取樣有關(guān)。在實(shí)際生產(chǎn)中,為確保壇內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定,減少雜菌的污染,采用的是密封發(fā)酵。

PCoA分析是最適用于展現(xiàn)樣品組間與組內(nèi)的微生物多樣性的方式,是基于UPGMA(Weight-UniFrac)層次聚類(lèi)分析獲得的PCoA分析2D示意圖。如圖3所示,通過(guò)對(duì)同一發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的壇子肉與蘿卜絲在PCoA分析的2D示意圖中的距離比較發(fā)現(xiàn),75 d壇子肉與75 d蘿卜絲的距離最近,說(shuō)明75 d壇子肉與75 d蘿卜絲的微生物結(jié)構(gòu)組成最為相似,這應(yīng)該與發(fā)酵后期的壇內(nèi)微生物組成趨于平衡有關(guān)系。

圖3 PCoA分析2D示意圖

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉、蘿卜絲的物種注釋

采用RDP[16]和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間壇子肉、蘿卜絲中的微生物做物種注釋,采用Blast軟件進(jìn)行分類(lèi)比對(duì),具體的參數(shù)設(shè)置如下:RDP置信度0.8,blast比對(duì)最小identity為90%,最小query覆蓋度為80%,最大evalue為1e-5,evalue區(qū)間倍數(shù)為10倍。

聚類(lèi)柱狀圖即對(duì)豐度前20的物種進(jìn)行Bray-Curtis距離聚類(lèi),以展現(xiàn)物種分類(lèi)及樣品距離之間的關(guān)系,如圖4所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),壇子肉和蘿卜絲中的細(xì)菌群落的物種分類(lèi)越少,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)逐漸成為了優(yōu)勢(shì)物種。不同發(fā)酵時(shí)間壇子肉中厚壁菌門(mén)的豐度均高達(dá)98%以上,且隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),其豐度變化不大;而發(fā)酵蘿卜絲中厚壁菌門(mén)的豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),由88.30%(20 d蘿卜絲)上升到 99.97%(60 d蘿卜絲),二者差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果提示,壇子肉與蘿卜絲混合發(fā)酵環(huán)境下,壇子肉可促進(jìn)蘿卜絲中厚壁菌門(mén)豐度增加。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),發(fā)酵蘿卜絲中藍(lán)藻門(mén)(Cyanophyta)的豐度呈下降趨勢(shì),由7.47%(20 d蘿卜絲)下降到0%(60 d蘿卜絲);而發(fā)酵壇子肉中藍(lán)藻門(mén)的豐度卻呈上升趨勢(shì),由0.15%(20 d壇子肉)上升到0.45%。結(jié)果提示,混合發(fā)酵可能促進(jìn)了藍(lán)藻門(mén)由蘿卜絲向壇子肉轉(zhuǎn)移,壇子肉中藍(lán)藻門(mén)豐度的增加。變形菌門(mén)(Proteobacteria)在發(fā)酵20 d蘿卜絲中的豐度最高,為3.52%,其豐度隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)急劇下降,60 d 蘿卜絲中的豐度僅為0.02%;而壇子肉中的變形菌門(mén)得豐度呈上升趨勢(shì),由0.03%(20 d壇子肉)上升到 0.59%(75 d壇子肉)。結(jié)果提示,發(fā)酵可能促進(jìn)了變形菌門(mén)由蘿卜絲向壇子肉轉(zhuǎn)移,壇子肉中變形菌門(mén)豐度的增加。以上結(jié)果提示,蘿卜絲與壇子肉一起發(fā)酵,促進(jìn)了壇子肉中變形菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)豐度增加,以及蘿卜絲中厚壁菌門(mén)豐度增加。最終,壇內(nèi)細(xì)菌群落將趨于平衡,這與UPGMA層次聚類(lèi)分析及PCoA分析的結(jié)果一致。

圖4 門(mén)水平上各樣品細(xì)菌群落變化聚類(lèi)柱狀圖

由Bray-Curtis距離聚類(lèi)樹(shù)可知,20 d壇子肉與60 d蘿卜絲、40 d壇子肉與75 d蘿卜絲的聚類(lèi)較近且分支較短,說(shuō)明其菌群組成較相似。結(jié)果提示,發(fā)酵早期壇子肉(即20 d壇子肉、40 d壇子肉)的細(xì)菌群落與發(fā)酵中后期蘿卜絲(60 d蘿卜絲、75 d蘿卜絲)相似,這應(yīng)該與入壇蘿卜絲中豐富的細(xì)菌群落及其分泌的高活性酶、壇子肉中豐富的營(yíng)養(yǎng)成分(蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂肪),陶壇中的殘留的活菌(每次發(fā)酵結(jié)束后,陶壇是不清洗的,繼續(xù)下一輪的發(fā)酵)有關(guān),從而促進(jìn)了壇子肉在20 d內(nèi)迅速發(fā)酵,細(xì)菌群落豐度迅速增加。事實(shí)上,壇子肉在發(fā)酵的75 d中,發(fā)酵前期可能是其微生物迅速增殖、感官品質(zhì)(色、香、味、形、質(zhì))形成的階段,而發(fā)酵后期應(yīng)該是其后熟的階段,即壇內(nèi)細(xì)菌群落穩(wěn)定、壇子肉感官品質(zhì)進(jìn)一步完善,特別是風(fēng)味的進(jìn)一步提高。關(guān)于壇子肉發(fā)酵時(shí)間、后熟時(shí)間的確定,本項(xiàng)目組將進(jìn)一步做深入研究。

不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉、蘿卜絲中菌群在屬水平上的變化如圖5所示,細(xì)菌群落的相對(duì)豐度在屬水平上最高的是乳酸桿菌屬(Lactobacillus),在不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉中的豐度均大于99%(P>0.05),然而在20 d蘿卜絲中的豐度最低,為92.68%,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),蘿卜絲中乳酸桿菌屬豐度呈上升趨勢(shì),75 d 蘿卜絲中乳酸桿菌屬豐度為99.61%。藍(lán)細(xì)菌屬(Streptophyta)在不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉中的豐度均低于1%(P>0.05),且隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),而蘿卜絲中的豐度呈下降趨勢(shì);20 d蘿卜絲中豐度最高,為7.61%,75 d蘿卜絲中豐度最低,為0。伯克氏菌屬(Burkholderia)在20 d蘿卜絲中的豐度較高,占樣品菌群的2.95%,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)其豐度降低;伯克氏菌屬在壇子肉中的豐度均低于1%,無(wú)明顯變化規(guī)律(P>0.05)。以上結(jié)果與細(xì)菌群落在門(mén)水平上的豐度分析結(jié)果一致,即隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),壇內(nèi)細(xì)菌群落將趨于平衡。此外,不同發(fā)酵時(shí)間的壇子肉中均未檢出杜搟氏菌屬(Duganella)、類(lèi)芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、黃色桿菌屬(Flavobacterium)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus),其中杜搟氏菌屬、類(lèi)芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、紫色桿菌屬、黃色桿菌屬僅在20 d發(fā)酵蘿卜絲中檢出,其他發(fā)酵蘿卜絲中均未檢出。這可能與壇子肉中的高豐度乳酸桿菌有關(guān),乳酸桿菌能夠抑制雜菌生長(zhǎng)[17-18],此外,隨著蘿卜絲中乳酸桿菌豐度的提高,蘿卜絲中的雜菌也受到了抑制。

圖5 屬水平上各樣品細(xì)菌群落變化聚類(lèi)柱狀圖

由Bray-Curtis距離聚類(lèi)樹(shù)可知,20 d壇子肉與60 d蘿卜絲、40 d壇子肉與75 d蘿卜絲的聚類(lèi)較近且分支較短,說(shuō)明其菌群組成較相似,此結(jié)果與門(mén)水平上的 Bray-Curtis距離聚類(lèi)樹(shù)結(jié)果一致。

細(xì)菌物種分類(lèi)熱圖是基于不同分類(lèi)水平的物種豐度表繪制的,并經(jīng)過(guò)Z值轉(zhuǎn)化,將同一個(gè)菌的表達(dá)豐度進(jìn)行歸一化。從圖6可以看出,75 d壇子肉中色彩值大于1的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)最多,有7種,包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、丙酸桿菌屬、葡萄球菌屬、螺桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、假單胞菌屬、β-變形菌屬(Betaproteobacteria_unclassified)。60 d壇子肉中色彩值大于1的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)有3種,包括雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、螺桿菌屬。40 d壇子肉中色彩值大于1的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)有2種,包括雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬。20 d壇子肉中色彩值大于1的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)有4種,包括雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、四聯(lián)球菌屬。前人報(bào)道,乳酸菌屬[16]、鏈球菌屬、葡萄球菌屬[19]、片球菌屬(Micrococcus)和青霉菌屬(Penicillium)等是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌屬[20]。本試驗(yàn)中,雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬在壇子肉發(fā)酵的前60 d一直保持著較高的豐度,鏈球菌屬是20 d壇子肉中的優(yōu)勢(shì)菌屬,葡萄球菌屬是75 d壇子肉中的優(yōu)勢(shì)菌屬[21]。關(guān)于雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬在20、40、60 d壇子肉中均為優(yōu)勢(shì)菌屬,而在75 d壇子肉中不是優(yōu)勢(shì)菌屬,這與周慧敏等[22]、Essid等[23]、潘曉倩等[24]結(jié)果結(jié)果一致,即發(fā)酵肉中的乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵過(guò)程中呈先上升后下降的趨勢(shì)。

圖6 各樣品在屬水平的熱圖

棒狀桿菌屬、丙酸桿菌屬、螺桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、假單胞菌屬、β-變形菌屬是75 d壇子肉的優(yōu)勢(shì)菌屬,四聯(lián)球菌屬是20 d壇子肉的優(yōu)勢(shì)菌屬,這與前人報(bào)道不同[25],可能與蘿卜絲入壇發(fā)酵有關(guān)。

20 d蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)最多,60 d蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)最少,即蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌屬的種類(lèi)隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高。20 d蘿卜絲中色彩值大于1的主要優(yōu)勢(shì)菌有紫色桿菌屬、杜搟氏菌屬、黃色桿菌屬、類(lèi)芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、伯克氏菌屬、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、藍(lán)細(xì)菌屬;40 d蘿卜絲中色彩值大于1的優(yōu)勢(shì)菌屬有四聯(lián)球菌屬、葡萄球菌屬、螺桿菌屬(Helicobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)、根瘤菌屬、類(lèi)芽胞桿菌屬(Paenibacillus);60 d蘿卜絲中色彩值大于1的優(yōu)勢(shì)菌屬有乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium);75 d蘿卜絲中色彩值大于1的主要優(yōu)勢(shì)菌屬有乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、四聯(lián)球菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、根瘤菌屬、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)。以上結(jié)果提示,發(fā)酵初期蘿卜絲中的微生物群落的種類(lèi)很豐富,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)減少,并與同一發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的壇子肉中優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)接近,特別是發(fā)酵 60 d 時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)最為接近。另外,丙酸桿菌屬、螺桿菌屬、假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬、四聯(lián)球菌屬是發(fā)酵蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌屬,證實(shí)了之前的猜想,即壇子肉中的丙酸桿菌屬、螺桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、假單胞菌屬、四聯(lián)球菌屬可能與蘿卜絲入壇發(fā)酵有關(guān)。

3 結(jié)論

蘿卜絲隨壇子肉入壇發(fā)酵,隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),壇子肉中微生物的豐富度越來(lái)越高,多樣性增加,均勻度增加,說(shuō)明蘿卜絲入壇發(fā)酵促進(jìn)了壇子肉中微生物的生長(zhǎng)繁殖,特別是發(fā)酵第60 d的壇子肉及蘿卜絲中細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性明顯高于其他發(fā)酵階段的樣品。另外,壇子肉中的優(yōu)勢(shì)菌群主要包括乳酸桿菌屬、雙歧桿菌、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、螺桿菌屬等,不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的壇子肉及蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)差異較大,且壇子肉在不同發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)勢(shì)菌群與對(duì)應(yīng)發(fā)酵時(shí)間的蘿卜絲的優(yōu)勢(shì)菌群差異較大。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 d時(shí),壇子肉、蘿卜絲中的優(yōu)勢(shì)菌群均包括乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬,推測(cè)60 d發(fā)酵時(shí)間是壇子肉與蘿卜絲中乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬平衡的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。