侯 瑩,祁雪鶴,任 慧,洪詩雨,池宗豫,王鴻飛,許 鳳

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315211)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種四碳非蛋白氨基酸,以游離態(tài)的形式廣泛地存在于脊椎動物、植物和微生物中[1]。GABA在動物中作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有降血壓,防止動脈硬化等多種生理功效[2]。在正常生長的植物組織中,GABA的含量通常在0.3～32.5 μmol·g-1[3]。當(dāng)在缺氧、鮮切處理、鹽脅迫等逆境條件下,植物中的GABA含量會迅速積累[4-5]。前期研究發(fā)現(xiàn),不同切割強(qiáng)度對鮮切胡蘿卜中GABA的影響差異較大,且外源CaCl2處理能有效地誘導(dǎo)鮮切胡蘿卜GABA的富集[6]。高等植物中GABA主要是由L-谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)的作用下發(fā)生不可逆的脫羧反應(yīng)而形成,隨后GABA又在氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA transaminase,GABA-T)的作用下,生成琥珀酸半醛(Succinic semialdehyde,SSA),SSA在琥珀酸半醛脫氫酶(Succinic semialdehyde decarboxylase,SSADH)的作用下,形成琥珀酸,最后進(jìn)入三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA),這一代謝反應(yīng)被稱為GABA支路[7-8]。此外,有研究表明高等植物中的GABA也可以由多胺(polyamine,PAs)降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生[9]。多胺降解途徑是以腐胺(putrescine,Put)、精胺(spermine,Spm)、亞精胺(spermidine,Spd)在二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)的催化下生成4-氨基丁醛,然后再經(jīng)氨基醛脫氫酶(Aminoaldehyde decarboxylase,AMADH)的作用下生成GABA。

鮮切果蔬又名最小加工果蔬,微加工果蔬,輕度加工果蔬,即新鮮果蔬進(jìn)行分級整理、清洗、切分、保鮮、包裝等處理,并使產(chǎn)品保持生鮮狀態(tài)的制品。因其具有新鮮、方便、衛(wèi)生和快捷等優(yōu)點受到消費(fèi)者的青睞,逐漸成為城市果蔬消費(fèi)的主流[10]。獼猴桃(Actinidiachinensis)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),并且口感酸甜美味,易于去皮以及切分,適用于鮮切加工[11]。目前,大多數(shù)研究主要集中在如何控制獼猴桃產(chǎn)品品質(zhì)和病原微生物的生長來延長其貨架期,有關(guān)于鮮切獼猴桃GABA的代謝研究卻鮮有報道。

本論文選取獼猴桃為研究材料,研究鮮切處理對其GABA的影響,明確在鮮切處理下獼猴桃中GABA富集機(jī)理,對改善產(chǎn)品的營養(yǎng)和功能品質(zhì)具有重要的理論和實踐應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徐香獼猴桃 購自安徽省宿州市大土山果園,挑選完全成熟,大小均一,表面無機(jī)械損傷及病蟲害的獼猴桃作為實驗材料;GABA標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma-Aldrich公司;氯化鑭 分析級,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;苯酚 分析級,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇 色譜純,Sigma-Aldrich公司;腐胺、精胺 亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品 分析純(T≥98%),上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國藥分析純。

PAL-1型數(shù)顯測糖儀 遼寧賽亞斯科技有限公司;AFX-2001-U超純水機(jī) 上海純浦實業(yè)有限公司;SYNAPT G2超高效液相色譜儀 美國water公司;745型紫外分光光度計 上海美譜達(dá)科技有限公司;BPZ11D分析天平 德國賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 將果實新鮮、大小均勻、無鮮切處理、成熟度幾乎一致的獼猴桃用200 μL/L次氯酸鈉溶液浸泡消毒2 min,純水清洗后平鋪于實驗操作臺上瀝干表明水分。對獼猴桃進(jìn)行不同方式的鮮切處理,切片(半徑4～6 cm,厚度2～3 mm),切丁(以切好的原片為基礎(chǔ),切成2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的獼猴桃丁),將切好的獼猴桃置于鮮切盒(材質(zhì):塑料;尺寸:15 cm×10 cm×4 cm),每個鮮切組12盒樣品,每盒約100 g左右。未進(jìn)行切割處理的完整獼猴桃作為對照,對照組共有12顆獼猴桃。于4 ℃,相對濕度90%條件下貯藏,分別于0、3、6、9 h取樣,貯藏期間鮮切組隨機(jī)取3盒樣品取樣,對照組隨機(jī)取三顆獼猴桃為樣品,并于液氮中快速冷凍,置于-40 ℃冰箱中待用,同時取鮮樣用于品質(zhì)指標(biāo)的測定。

1.2.2 GABA含量的測定 GABA含量的測定參照Hu[12]等的方法并做一定修改。取0.5 g的冷凍樣品在3 mL的濃度為 0.05 mol/L的氯化鑭溶液中進(jìn)行提取,在室溫下?lián)u晃15 min后用12000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加入2 mol/L氫氧化鉀(200 μL),振蕩5 min后用12000 r/min離心5 min。取0.4 mL上清液依次加入800 μL硼酸鹽緩沖液(pH9.0)、體積分?jǐn)?shù)6%苯酚和5%次氯酸鈉,充分混勻后沸水浴10 min,并立即冰浴5 min。然后加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇,混勻后采用紫外分光光度在645 nm測定吸光度。結(jié)果以mg/g FW來表示。

1.2.3 谷氨酸含量的測定 谷氨酸含量測定的方法參照參考Al-Quraan等[13]的方法并加以修改。取0.5 g的樣品在0.05 mol/L的氯化鑭溶液中進(jìn)行冰浴研磨,將0.02 mL的冷凍樣品提取物加入0.2 mL的反應(yīng)溶液中。反應(yīng)溶液含有0.2 mL Tris-HCl(0.1 mol/L,pH8.3)、0.1 mLβ-NAD+(7.5 mmol/L)和1 U/mL谷氨酸脫氫酶懸液。在30 ℃孵育60 min后,記錄340 nm處吸光度的變化。谷氨酸水平以NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ),每生成1 mmol NADH則消耗1 mmol谷氨酸,結(jié)果用mmol/kg FW來表示。

1.2.4 GAD活性的測定 GAD活性的測定參照Liao等[14]的方法并加以修改:將0.5 g冷凍樣品在3 mL含5 mmol/Lβ-巰基乙醇、0.5 mmol/L磷酸吡哆醛、2 mmol/L EDTA和100 g/L甘油的100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH5.8)中勻漿。提取的勻漿在10000 r/min、4 ℃下離心20 min,上清液即為粗酶液。將0.5 mL 酶提液加入含10 g/L 谷氨酸的0.2 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L,pH5.8)中,40 ℃水浴2 h,在水浴中煮沸終止反應(yīng)。每小時反應(yīng)溶液中1 μmol/L GABA的生成為GAD活性的一個單位。

1.2.5 GABA-T活性的測定 GABA-T活性的測定參照Wang等[6]的方法并加以修改:取0.5 g冰凍組織樣品在3 mL含有10%甘油、1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)、1 mmol/L苯甲磺酰氟(PMSF)的100 mmol/L Tris-HCl(pH9.1)中均質(zhì),在12000 r/min下,4 ℃離心20 min,得粗酶液。反應(yīng)體系由50 mmol/L三氯化氫(pH8.2),0.75 mmol/L EDTA,1.5 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PLP,16 mmol/L GABA。10%(v/v)甘油,4 mmol/L 丙酮酸和0.5 mmol/L 酶提取物組成。在30 ℃孵育60 min后,加入0.1 ml 100 mmol/L磺基水楊酸(SSA),使反應(yīng)中止。GABA-T活性被定義為每小時催化生成1 μg丙氨酸為一個酶活單位。

1.2.6 多胺含量的測定 多胺的測定參照Zhu等[15]的方法并加以修改:取獼猴桃冷凍樣品1.0 g加入3 mL提前預(yù)冷的高氯酸溶液(5%,v/v)進(jìn)行冰浴研磨,將研磨后樣品冰浴1 h,在4 ℃,15000 r/min下離心30 min。取2 mL上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中,加入2 mol/L NaOH(2 mL),再加入10 μL苯甲酰氯,渦漩20 s后在37 ℃水浴30 min。再加入飽和NaCl溶液(4 mL),混勻后用乙醚(2 mL)進(jìn)行充分地萃取,在3000 r/min條件下離心5 min,取1 mL醚相用氮吹儀吹干,用色譜級甲醇(500 μL)溶解,最后得到待測定的多胺樣品。采用高效液相色譜進(jìn)行多胺含量的測定。色譜柱為反相C18柱(150×3.9 mm,4 μm),柱溫30 ℃;流動相為甲醇和水(比例為10∶40,v/v);檢測波長230 nm;流速0.7 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.7 DAO、PAO和AMADH活性的測定 DAO和PAO的活性測定參照Gao等[16]的方法并加以修改:冷凍樣品(2.0 g)在5.0 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中均質(zhì),在12000 r/min、4 ℃下離心20 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系中含有2.0 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.5),0.2 mL 4-氨基安替比林/N,N-二甲基苯胺顯色溶液,0.1 mL辣根過氧化物酶(250 U/mL),0.5 mL酶提取液。分別加入0.5 mL Put溶液(20 mmol/L)和0.5 mL Spd+Spm混合溶液(各20 mmol/L)啟動反應(yīng),進(jìn)行DAO和PAO活性測定。在555 nm處吸光度值每變化0.001被定義為酶活的一個單位。

AMADH的方法測定基于Petrivalsky等人[17]的方法,并做了一些修改。將冷凍樣本在含5 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA和10%蔗糖的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中勻漿。在4 ℃、12000 r/min離心30 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系中含有100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0),1 mmol/L NAD+和1 mmol/L ABAL,加入0.5 mL粗酶液啟動反應(yīng)。在340 nm測定吸光值,每分鐘的吸光度變化0.001,被定義為該酶活性的一個單位。

1.2.8 菌落總數(shù)測定 菌落總數(shù)參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》測定。

1.2.9 可滴定酸的測定 可滴定酸的測定參照劉小陽等[18]的方法:取50 g鮮樣研磨后離心,取3 mL上清液加5 mL蒸餾水,再滴加3～4滴酚酞溶液,用0.1% NaOH溶液進(jìn)行滴定,至出現(xiàn)淡紅色,記下NaOH溶液的用量。重復(fù)測定3次。

1.2.10 可溶性固形物含量測定 可溶性固形物的含量測定參照郭丹等[19]的方法:取一定量的新鮮樣品研磨,勻漿過濾測定,采用PAL-1型數(shù)顯測糖儀測定可溶性固形物含量,重復(fù)3次。

1.2.11 維生素C的測定 維生素C的測定參照何靖柳等[20]的方法:取5 g新鮮樣品加入適宜的2%草酸研磨,離心后取1 mL上清液用已經(jīng)標(biāo)定好的1,2-二氯酚靛酚滴定,至出現(xiàn)粉紅色且在15 s內(nèi)不褪色為止,記下染料的用量。重復(fù)測定三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 9.0和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行差異顯著性檢驗,P<0.05為差異顯著。以上指標(biāo)均取3個平行樣,重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同損傷強(qiáng)度對獼猴桃中GABA含量的影響

由圖1可知,經(jīng)過鮮切處理的獼猴桃中GABA的含量高于未經(jīng)處理的獼猴桃,與切片組相比,切丁組的GABA含量更高,且GABA含量在貯藏期間呈先上升后下降趨勢,在貯藏時間為6 h時切丁組中的GABA含量達(dá)到了峰值。這可能是由于鮮切處理嚴(yán)重破壞了獼猴桃細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),使細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子和氫離子含量增加,激活了GABA代謝的相關(guān)酶活性,進(jìn)而促進(jìn)了GABA的積累[21]。同時初步確定在鮮切處理脅迫條件下獼猴桃中GABA富集的最佳鮮切形式為切丁,最佳貯藏時間為6 h,故取切丁組進(jìn)行下一步實驗。

圖1 損傷強(qiáng)度對獼猴桃中GABA含量的影響

2.2 鮮切處理對谷氨酸含量、GAD活性以及GABA-T活性的影響

2.2.1 鮮切處理對谷氨酸含量的影響 由圖2可知,對照組和切丁組的谷氨酸含量在總體上呈下降的趨勢,可能在較低的貯藏溫度下對獼猴桃存在著低溫脅迫,提高了GAD活性,使獼猴桃中谷氨酸轉(zhuǎn)化成GABA[5]。貯藏過程中,切丁組谷氨酸含量在前6 h顯著低于對照組(P<0.05)。谷氨酸是GABA支路中合成GABA的前體,這可能是切丁處理激活GABA支路促使谷氨酸轉(zhuǎn)化合成GABA[22]。

圖2 鮮切處理對獼猴桃中谷氨酸含量的影響及NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 鮮切處理對GAD和GABA-T活性的影響 由圖3A可知,對照組的GAD活性在前3 h并無顯著性差異,在6 h迅速升高，可能是較低的貯藏溫度下對獼猴桃存在著低溫脅迫,激活了對照組中GAD活性[4]。切丁組中的GAD活性在貯藏期間并無顯著性差異,且切丁組的GAD活性顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明,鮮切處理能提高獼猴桃中GAD活性,促進(jìn)谷氨酸向GABA轉(zhuǎn)化,使得GABA的積累,也進(jìn)一步解釋了切丁獼猴桃中谷氨酸含量降低的原因。對照組的GABA-T活性在貯藏期間無顯著變化,而切丁組中的GABA-T活性呈現(xiàn)先增加再下降的趨勢。與對照組相比,切丁組的GABA-T活性顯著(P<0.05)低于對照組(圖3B)。GAD是GABA支路的限速酶,兩者對植物中GABA的積累起著至關(guān)重要的作用。Koike等[23]發(fā)現(xiàn),用CO2處理番茄果實,其體內(nèi)的GABA含量顯著增加,這主要歸因于CO2處理降低了GABA-T的活性,減緩了GABA的降解。本研究發(fā)現(xiàn),切丁獼猴桃的GABA-T活性顯著低于對照組(圖3B),這表明鮮切處理后GABA含量的提高可能和較高的GAD活性和較低的GABA-T活性有關(guān),這與Deewatthanawong等[24]的研究結(jié)果相一致。

圖3 鮮切處理對GAD和GABA-T活性的影響

2.3 鮮切處理對多胺含量的影響

鮮切處理對獼猴桃中多胺(腐胺、精胺、亞精胺)含量的影響見圖4。切丁組中的腐胺含量在前6 h無顯著變化,之后迅速減少;對照組在前6 h逐漸增加,然后開始下降,這可能是在貯藏前期,較低的DAO活性促進(jìn)了腐胺的積累,在貯藏后期,隨著DAO活性的提升,腐胺開始降解;與對照組相比,切丁處理顯著的抑制了腐胺的產(chǎn)生(圖4 A)。由圖4B可知,對照組中的精胺含量在貯藏期間無顯著變化,而切丁組的精胺含量呈下降趨勢。對照組中的亞精胺含量呈先上升再下降的趨勢,而切丁組的亞精胺含量隨著貯藏時間逐步下降,并且顯著低于對照組(圖4C)。這些結(jié)果表明,經(jīng)過鮮切處理顯著降低了獼猴桃中腐胺、精胺和亞精胺的含量(P<0.05),從而激活獼猴桃中的多胺降解途徑,促進(jìn)GABA積累。

圖4 鮮切處理對獼猴桃中多胺(腐胺、精胺、亞精胺)含量的影響

2.4 鮮切處理對胺氧化酶活性的影響

由圖5A可知,對照組和切丁組的DAO活性均在前6 h逐步上升,在6 h時到達(dá)最大值,隨后逐漸下降。與對照組相比,鮮切處理顯著增加了DAO的活性。切丁組的PAO活性在前6 h迅速增加,并在6 h時達(dá)到最大值,之后緩慢下降。與對照組相比,切丁組的PAO活性顯著增強(qiáng)(圖5B)。由圖5C可知,對照組獼猴桃中AMADH活性在貯藏期間緩慢增加,而切丁組中AMADH活性在前3 h顯著增強(qiáng),并在3 h達(dá)到最大值,之后逐漸下降。AMADH屬于醛脫氫酶,它能夠?qū)⒅参镏卸喟方?jīng)胺氧化酶(DAO和PAO)氧化產(chǎn)生的4-氨基丁醛直接進(jìn)行脫氨反應(yīng)生成GABA[15]。Wu等[25]研究發(fā)現(xiàn),在厭氧脅迫下,福鼎白茶大約37%～47%的GABA產(chǎn)生于多胺降解途徑。在本研究中,低溫貯藏略微提升了對照組中DAO和PAO的活性,與對照組相比,切丁組的獼猴桃具有更高的DAO、PAO和AMADH活性(圖5A、5B和5C)。這可能是切割處理激活了多胺氧化酶的活性,促進(jìn)更多的多胺降解成GABA。然而,多胺代謝是由多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑控制的一個非常復(fù)雜的過程,還需要進(jìn)一步的研究[26]。

圖5 鮮切處理對獼猴桃中胺氧化酶(二胺氧化酶、多胺氧化酶、4-胺基丁醛脫氫酶)活性的影響

2.5 鮮切處理對菌落總數(shù)、可滴定酸、維生素C、可溶性固形物含量的影響

菌落總數(shù)是用來評價鮮切果蔬安全性以及貨架期的指標(biāo)。據(jù)報道[27],鮮切果蔬的菌落總數(shù)通常不超過106CFU·g-1。圖6A表明,鮮切獼猴桃菌落總數(shù)在4 ℃貯藏期間持續(xù)增長,但在貯藏時間分別為0、3、6、9 h時菌落總數(shù)未超過106CFU·g-1,仍然在可食用范圍內(nèi)。如圖6B所示,在貯藏期間,切丁組的可滴定酸含量呈下降趨勢,但與對照組相比沒有顯著性差異(P<0.05)。對照組和切丁組的可溶性固形物含量在貯藏期間都呈下降趨勢,且在6 h后切丁組的可溶性固形物含量顯著低于對照組(圖6C)。獼猴桃以VC含量高而著稱,有著“VC之王”的美譽(yù),VC也是衡量獼猴桃果實貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖6D可知,在貯藏期間,切丁組和對照組在較短的貯藏時間內(nèi)(9 h)VC含量并無顯著性差異。這些結(jié)果表明,在此切割處理(切丁)和貯藏條件下(4 ℃和9 h),較好地保持了鮮切獼猴桃的品質(zhì)。

圖6 鮮切處理對菌落總數(shù)、可滴定酸、維生素C、可溶性固形物含量的影響

3 結(jié)論

GABA是逆境條件下生物體緩解細(xì)胞酸化對自身毒害作用的產(chǎn)物[28]。大量證據(jù)表明,當(dāng)植物受到缺氧脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫和鮮切處理脅迫時,GABA會大量積累以緩解脅迫環(huán)境對植物造成的損傷[22,29]。在本研究中,低溫貯藏略微提升了對照組獼猴桃的GAD、DAO和PAO活性,促進(jìn)了對照組中谷氨酸的降解,同時鮮切處理可顯著提高獼猴桃中GABA的積累,相對于對照組,切丁獼猴桃中GAD、DAO、PAO和AMADH活性提高顯著,GABA-T活性被抑制。

果蔬經(jīng)過鮮切處理后,結(jié)構(gòu)和組織會遭到破壞,營養(yǎng)物質(zhì)也會隨之流失,變得容易腐爛。在本研究中,最大菌落總數(shù)、VC和可滴定酸含量在對照組和切丁組之間均無顯著性差異,而切丁組的可溶性固形物含量略低于對照組,這可能與貯藏溫度(低溫)和短時間(9 h)有關(guān)。由此可知,鮮切處理誘導(dǎo)鮮切果蔬中GABA的富集可能具有普遍性,在確保產(chǎn)品感官品質(zhì)和食用安全性基礎(chǔ)上,應(yīng)用鮮切加工誘導(dǎo)GABA的合成有望成為提高果蔬產(chǎn)品營養(yǎng)保健功效的重要手段,也是鮮切果蔬加工保鮮技術(shù)研究的發(fā)展方向。