蔡志英，施玉萍，戴利銘，高 鋒，龍青姨，毛常麗，穆洪軍

（云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪666100）

天然橡膠是全球重要的戰(zhàn)略性物資，也是關系我國國計民生的可再生資源，迄今為止已有100多年的栽培歷史。1906年，斯里蘭卡首次報道橡膠樹炭疽病為害，目前該病已廣泛分布于非洲、南美洲、亞洲等地的橡膠種植國［1-3］。該病害在我國早期僅在苗圃和幼樹上發(fā)現(xiàn)，上世紀60年代初期在海南的開割膠樹上首次發(fā)現(xiàn)少數(shù)橡膠品系整年因病落葉而導致停割。1992年，該病在海南暢好橡膠農(nóng)場大面積爆發(fā)，發(fā)病面積達1 550.53 hm2，占開割膠樹的75%，受害樹30多萬株，造成20多萬株橡膠樹重度落葉，損失干膠達250 t［4］。目前該病日趨嚴重。

炭疽菌分布廣泛，其種內(nèi)變異較多，寄主范圍廣，能引起谷類、蔬菜、果樹、林木等多種作物炭疽病發(fā)生，導致嚴重產(chǎn)量損失［5-8］。該菌可侵染橡膠樹的葉、花和果，嚴重時誘發(fā)落葉，嫩梢回枯以及橡膠樹果實腐爛［4，6］。目前炭疽菌已成為研究植物寄生真菌的生長、發(fā)育、侵染過程、信號轉(zhuǎn)導、寄主與微生物互作機理的模式菌株［9］。α-淀粉酶是生物體內(nèi)參與淀粉水解的一類重要酶，了解橡膠樹炭疽菌HK-36菌株α-淀粉酶家族基因，對深入研究該家族基因功能有著重要意義。

α-淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖苷水解酶）是生物體分泌的一種重要的淀粉水解酶，它水解淀粉和糖原中的α-1，4-D-糖苷鍵，產(chǎn)生短的麥芽低聚糖和麥芽糖。大多數(shù)α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）屬于糖苷水解酶（GH）家族13［10-11］。淀粉不能直接透過細胞膜，沒有淀粉酶微生物就不能利用淀粉。微生物先分泌胞外α-淀粉酶內(nèi)切α-1，4-糖苷鍵將淀粉水解成雙糖和單糖，然后再攝入體內(nèi)利用［12］。從微生物中提取的α-淀粉酶已大量應用于食品工業(yè)、釀造、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等，是應用最為廣泛、最重要的工業(yè)酶之一。目前已知真菌來源的α-淀粉酶多數(shù)為曲霉屬、青霉屬、木霉屬、根霉屬和酵母屬。對真菌來源的α-淀粉酶基因功能的研究多集中于工業(yè)上應用較廣的曲霉屬微生物。從黑曲霉基因組中發(fā)現(xiàn)6種α-淀粉酶，分 別 為aamA、amyA、amyB、amyC、amyD和amyE。其中amyD與amyE淀粉酶參與細胞壁α-葡聚糖的合成；amyC是一種前導酶，在異麥芽糖或麥芽糖誘導下激活AmyR（淀粉酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因），以誘導其他淀粉酶水解酶表達，amyC的表達量非常低，目前研究相對少；aamA基因的表達產(chǎn)物是耐酸性α-淀粉酶水解酶，amyA和amyB兩個基因的相似度非常高，與米曲霉的Taka-淀粉酶相似度大于98%［13-14］。

α-淀粉酶基因家族在炭疽菌中的分布、數(shù)量、基因結(jié)構(gòu)以及其在炭疽菌中的生長發(fā)育過程中的作用知之甚少。通過對基因組的信息分析，以期望發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律和相互關系。本文借助炭疽菌HK-36菌株基因組測序數(shù)據(jù)和生物信息學方法分析炭疽菌α-淀粉酶基因家族的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)特征和功能，為進一步深入研究炭疽菌中α-淀粉酶基因家族奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 α-淀粉酶家族成員鑒定

本項目組前期已對野生型橡膠樹炭疽菌HK-36菌株進行全基因組測序（序列未公布），用已知真菌的α-淀粉酶氨基酸序列［15-17］，利用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件比對HK-36菌株全基因組測序數(shù)據(jù)（E-Value≤1e-6），找出α-淀粉酶家族成員基因。

1.2 α-淀粉酶家族基因結(jié)構(gòu)、基本特征分析

利用FGENESH在線工具，以Colletotrichum gloeosporioides、C.graminicola和C.higginsianum菌株為 參 比（http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfind/）進 行 基 因結(jié)構(gòu)分析［18］。使 用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)（分子式、分子量、等電點和親水系數(shù)）。分別采用HMMTOP（http：//www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）、Euk-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）、SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進行蛋白的跨膜螺旋［19］、亞細胞定位［20］和信號肽分析［21］。

1.3 α-淀粉酶家族蛋白系統(tǒng)進化分析

從NCBI中下載曲霉α-淀粉酶的氨基酸序列，用Clustal Omega軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行氨基酸多序列比對，用MEGA 6.0軟件鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹的可靠性采用Bootstrap-Method 1 000次重復檢驗，分析蛋白系統(tǒng)進化關系。

1.4 預測α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族二級與三級結(jié)構(gòu)

根據(jù)同源預測和建模的原理，用在線工具PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）蛋 白 質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族二級結(jié)構(gòu)分析。使用工具SWISS-MODEL/SWISS-PdbViewer（http：//swissmodel.expasy.org/）預測 蛋 白質(zhì) 三 級結(jié)構(gòu)分析。采用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro）進行蛋白結(jié)構(gòu)域的分析，應用程序選擇HMMPfam、HMMSmart和SuperFamily。

1.5 α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族基因家族啟動子順式作用元件分析

用CgAmys家族成員基因開放閱讀框起始密碼子ATG前端的1450 bp的核酸序列，用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析CgAmys家族成員基因的啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件［22］，并按功能進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族

用已知真菌的29個α-淀粉酶氨基酸序列，利用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件程序搜索橡膠樹HK-36炭疽菌株全基因組核酸序列（EValue≤1e-6），共找出5個推定的α-淀粉酶基因，分別命名為CgAmy1～CgAmy5，基因序列已提交NCBI（登 錄 號 分 別 為：MN637822、MN637823、MN637824、MN637825和MN637826）。該菌α-淀粉酶酶推導基因編碼蛋白的氨基酸平均數(shù)目為529.8個，其中CgAmy2的最大的含有549個氨基酸，CgAmy3的最小含有500個氨基酸（表1）。

2.2 α-淀粉酶蛋白家族基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)分析及蛋白系統(tǒng)進化

分析橡膠樹炭疽菌HK-36菌株α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族基因內(nèi)含子、外顯子發(fā)現(xiàn)，CgAmy3基因含有6個外顯子，CgAmy1和CgAmy4基因外顯子數(shù)量為3，CgAmy2基因含有2個外顯子，CgAmy5基因僅含有1個外顯子（圖1）。α-淀粉酶基因編碼序列長度介于1 593（CgAmy5）～1 805（CgAmy4）bp之間；蛋白分子量介于57.2（CgAmy3）～61.5（CgAmy1）kDa，平均分子量為59.48 kDa；等電點介于4.59（CgAmy4）～6.12（CgAmy1），均為親水性蛋白，蛋白呈酸性；HK-36菌株α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族基因CgAmy1～CgAmy5都未預測到跨膜螺旋；通過在線工具Euk-mPLoc預測到CgAmy1定位于溶酶體和質(zhì)膜，CgAmy2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，CgAmy3定位于過氧物酶體，CgAmy4和CgAmy5定位于線粒 體；其 中CgAmy2、CgAmy4和CgAmy5酶 蛋 白具有信號肽（表1）。

2.3 α-淀粉酶蛋白家族系統(tǒng)進化分析

通過鄰位相連法對曲霉屬（Aspergillus niger、A.shirousamii、A.awamori、A.oryzae）踝節(jié)菌屬埃默森藍狀菌（Rasamsonia emersonii）和羅克福爾青霉菌（Penicillium roqueforti）等其他23個α-amylase蛋白序列進行系統(tǒng)聚類分析（圖2）。α-amylase蛋白被分成3個亞組，亞組I包含13個α-amylase蛋白；亞組II包含CgAmy2、CgAmy4和CgAmy5等9個αamylase蛋 白；亞 組III包 含CgAmy1和CgAmy3等6個α-amylase蛋白。

表1 CgAmy基因家族及其推導的蛋白的基本特征

2.4 α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族二級和三級結(jié)構(gòu)預測

如圖3-A所示，CgAmys蛋白N端由延長鏈和螺旋結(jié)構(gòu)組成，C端基本由延長鏈組成。CgAmys蛋白的延長鏈數(shù)量在20（CgAmy1）～26（CgAmy5），其中CgAmy3和CgAmy4延長鏈數(shù)量均為22，CgAmy2蛋白延長鏈數(shù)量均為25；CgAmys蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量介于11（CgAmy3）～18（CgAmy5），CgAmy1、Cg-Amy2和CgAmy4蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量分別為14、16和15（圖3-A和表1）。CgAmys三級結(jié)構(gòu)也表明α-淀粉酶家族蛋白含有多個螺旋、延長鏈及回折結(jié)構(gòu)。Swiss-Model分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CgAmy1和CgAmy3結(jié) 構(gòu) 幾 乎 相 同，CgAmy2和CgAmy4結(jié) 構(gòu) 相似。這一結(jié)果與CgAmys蛋白系統(tǒng)進化分析相吻合，CgAmy1和CgAmy3聚 類 在 一 個 亞 組，CgAmy2和CgAmy4位于同一進化枝上。

CgAmys蛋白具有同源α-淀粉酶蛋白家族指紋Glycoside hydrolase superfamily（IPR017853）和Glycosyl hydrolase，all-beta（IPR013780），同 時 含Glyco_hydro_13_cat_dom（IPR006047）結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的酶屬于糖基水解酶家族13（GH 13）。α-淀粉酶是一種催化水解多糖中（1-4）-α-D-葡萄糖鍵的酶，在淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖的過程中，從糖鏈的非還原端去除α-麥芽糖殘基。Glyco_hydro_13_cat_dom（IPR006047）的催化結(jié)構(gòu)域中有一個（α/β）8桶狀結(jié)構(gòu)，其中包含活性位點。70氨基酸鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于第3個β鏈和第3個α螺旋之間，羧基端有個β折疊的Greek key桶狀結(jié)構(gòu)域。此外CgAmy4和CgAmy5還含有A_amylase_DUF1966_C（IPR015340）結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域存在于各種真菌α-淀粉酶蛋白中。到目前為止，它的確切功能還沒有被定義。

2.5 CgAmys基因家族啟動子順式作用元件

通過CgAmys家族各成員基因的啟動子元件分析結(jié)果表明（表2），除含有TATA box核心啟動子元件和CAAT框等外，主要涉及激素響應和非生物逆境脅迫應答和生長調(diào)節(jié)。CgAmys基因家族各成員都具有茉莉酸應答順式作用元件（TGACG-motif），此外還有赤霉素、水楊酸、脫落酸和生長素多種激素的響應元件，推測CgAmys對茉莉酸的響應還受其他激素共同調(diào)節(jié)，可能涉及一個較復雜的信號傳遞網(wǎng)絡。

3 討論

α-淀粉酶是一種催化水解多糖中（1-4）-α-D-葡萄糖鍵的酶，在淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖的過程中，從糖鏈的非還原端去除α-麥芽糖殘基。目前關于α-淀粉酶基因功能研究多見于模式菌株黑曲霉（Aspergillus niger）［23-26］，但是在橡膠樹炭疽菌中該類基因的功能研究至今未見報道。本研究利用生物信息學方法鑒定HK-36菌株α-淀粉酶基因家族，對比分析該菌α-淀粉酶家族成員的基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、啟動子元件，蛋白三維結(jié)構(gòu)等，有助于進一步解析真菌CgAmy基因在生長發(fā)育及逆境脅迫響應中的功能。

表2 Amy基因家族上游順式作用元件

微生物α-淀粉酶通常含有3個結(jié)構(gòu)域（被命名為A、B和C結(jié) 構(gòu) 域）。A為α-淀粉酶催化反應中心結(jié)構(gòu)域，其典型特征為（α/β）8 TIM桶 狀 結(jié) 構(gòu)，B和C結(jié)構(gòu)域大多位于A結(jié)構(gòu)域的兩邊。其中Ca2+的保守結(jié)合位點在A和B結(jié)構(gòu)域之間，通常Ca2+對α-淀粉酶家族保持活性和穩(wěn)定性是必不可少的［27］。本研究通過InterProScan分析炭疽菌HK-36菌株CgAmys家族蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，CgAmys基因的推定蛋白都含Glyco_hydro_13_cat_dom（IPR006047）結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白酶屬于糖基水解酶家族13（GH 13）。這個催化結(jié)構(gòu)域有一個（α/β）8 TIM桶狀結(jié)構(gòu)，其中包含活性位點。70個氨基酸鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于第3個β鏈 和 第3個α螺 旋 之 間，羧 基 端 有 個β折 疊 的Greek key桶狀結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)果與前人的研究報道相吻合，炭疽菌株HK-36的CgAmys家族的推導，它們的推導蛋白都含有（α/β）8 TIM桶狀催化結(jié)構(gòu)域和鈣結(jié)合位點。此外，CgAmy4和CgAmy5還 含 有A_amylase_DUF1966_C（IPR015340）結(jié) 構(gòu)域，暗示它們可能具有其他的功能。

基因的內(nèi)顯子/外含子結(jié)構(gòu)數(shù)量可作為重要的進化印記，揭示家族基因各成員間的進化關系［28-29］。在 炭 疽 菌 株HK-36的CgAmys蛋 白 基 因 家族中，CgAmy5沒 有 內(nèi) 含 子。而其他4個CgAmys蛋白基因具有1～5個內(nèi)含子，可能是在CgAmy5基礎上進化而來。尤其是CgAmy3具有高達5個內(nèi)含子，在進化中可能經(jīng)歷了多次外顯子重排或內(nèi)含子插入等，屬于CgAmy家族基因中最新的。

系統(tǒng)進化分析推斷炭疽菌株HK-36的5個α-淀粉酶可能來源于一個共同的祖先，但進化成二個亞組。現(xiàn)有研究結(jié)果表明亞組I對淀粉水解具有較高的活性［15］；亞組II為糖基磷脂酰肌醇錨定α-淀粉酶，它們對淀粉的水解活性很低，但對麥芽糖和淀粉的α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性很高［25］；亞組III為胞內(nèi)α-淀粉酶，對淀粉的水解活性相對較低，這些酶可能與細胞壁α-葡聚糖合成有關［26］。

通過CgAmys家族基因上游序列的啟動子元件分析，發(fā)現(xiàn)該家族基因的啟動子區(qū)域有不同的順式元件，表明它們的表達很可能受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。CgAmys基因家族各成員都具有茉莉酸響應元件（TGACG-motif），預示這些基因的表達可能受茉莉酸調(diào)控。此外，CgAmys基因上游序列的啟動子區(qū)還具有赤霉素、水楊酸、脫落酸和生長素多種激素的響應元件，暗示CgAmys基因家族可能涉及一個較為復雜的信號傳輸網(wǎng)。關于赤霉素調(diào)控α-淀粉酶基因的表達在水稻糊粉層細胞中已經(jīng)得到證實，受赤霉素刺激水稻糊粉層細胞中Ca2+-ATP酶和Ca2+通道共同調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度，以刺激α-淀粉酶基因的表達［30］。

4 結(jié)論

通過生物信息學分析，在炭疽菌株HK-36的基因組篩選到5個α-淀粉酶基因。通過氨基酸序列的多重比對分析，這5個α-淀粉酶基因的推導蛋白分別聚類在II和III亞組，亞組II包含CgAmy2、CgAmy4和CgAmy5等9個α-amylase蛋白；亞組III包含CgAmy1和CgAmy3等6個α-amylase蛋白。CgAmys基因上游序列的啟動子區(qū)存在茉莉酸赤霉素、水楊酸、生長素和脫落酸多種激素的應答元件。但是，CgAmys基因所包含的順式元件不盡相同，說明它們可能具有不同的功能。本文借助炭疽菌HK-36菌株基因組測序數(shù)據(jù)和生物信息學方法分析炭疽菌α-淀粉酶基因家族的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)特征和功能，為進一步深入研究炭疽菌中α-淀粉酶基因家族奠定基礎。