王琴，馬鑫，徐靜，潘璐，張嬌，劉羅娜

1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院心臟中心功能檢查部，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學，寧夏銀川 750004； *通訊作者 王琴13995290877@163.com

近年來，越來越多的臨床和解剖學資料發(fā)現(xiàn)，肥胖導致的心臟病患者在出現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化前已出現(xiàn)心臟結構和功能的改變[1]，但早期肥胖患者的心臟結構與功能改變進程尚未明確。目前認為肥胖是一種慢性代謝性炎癥，是發(fā)生在脂肪組織的炎癥狀態(tài)。多種內源性或外源性危險信號通過激活NLRP3 炎癥小體上調炎性因子的表達水平、介導細胞凋亡，從而促進慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展[2]。因此，深入研究NLRP3炎癥小體激活機制對肥胖早期心肌損傷防治具有重要意義。本研究應用超聲生物顯微鏡（ultrasound biomicroscopy，UBM）追蹤觀察肥胖小鼠及正常小鼠心肌應變及二維超聲的測值，并通過檢測NLRP3 炎癥小體蛋白水平表達，分析UBM 在監(jiān)測肥胖小鼠早期心肌損傷改變的作用及肥胖小鼠心肌損傷改變與NLRP3 炎癥因子的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取120 只6 周齡雄性C57BL/6 小鼠（合格證號為20180006001186），體重20～30 g，喂以高脂飼料。選取體重及Lee’s 指數(shù)分別大于對照組平均±1.5 倍標準差的肥胖小鼠模型60 只，分為肥胖模型組、肥胖+慢病毒空載體組、肥胖+NLRP3-miRNA 慢病毒組，每組20 只。肥胖+NLRP3-miRNA慢病毒組小鼠經頸靜脈注射NLRP3-miRNA 慢病毒，劑量0.2×108TU/只，干預時間8 周。另納入20 只C57BL/6 小鼠與實驗組同齡、同性別小鼠作為對照組。涉及動物所執(zhí)行的程序均獲得寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 UBM 檢查方法

1.2.1 儀器及實驗動物準備 采用Vevo 2100 高分辨超聲成像系統(tǒng)（Visualsonics 公司），配置30 MHz 探頭，分辨率40 μm，選用RMV-707B 單晶片機械扇掃探頭，探頭頻率30 MHz。使用2%異氟烷麻醉小鼠，以仰臥位固定于恒溫平臺上，固定四肢并連接在心電圖電極。成像前使用化學脫毛劑脫去胸部毛發(fā)。麻醉開始后，采集小鼠心率平穩(wěn)時的超聲心動圖數(shù)據(jù)。

1.2.2 UBM 檢查方法 經胸骨左緣、心尖等掃查窗口。分別采用二維、M 型和多普勒采集左心室長軸及各水平短軸、心尖四腔心切面，進而測量其內徑，并獲得各瓣口的血流頻譜。分析左心收縮及舒張功能。動態(tài)觀察小鼠左心室超聲生物學特性，包括形態(tài)學、血流動力學、功能、應變的變化。形態(tài)學改變包括采集左心室長軸切面，測得室間隔左心室后壁厚度及左心室舒張及收縮內徑。應用M 型超聲測定室間隔及左心室后壁，左心室收縮末期內徑（Ds）及舒張末期內徑（Dd）。用Teichholtz 校正公式計算左心室射血分數(shù)（LVEF）；血流動力學分析測定二尖瓣口舒張早期血流速度（E）、舒張晚期血流速度（A）及兩者的比值；應用應變及應變率顯像技術（VevoStrain，VisualSonics）測定左心室心肌應變及應變率參數(shù)。徑向和圓周應變及應變率由乳頭肌左心室短軸切面測得。軟件自動追蹤心內膜得出心肌整體應變及應變率曲線，獲得各切面心肌應變及應變率參數(shù)。

1.2.3 心肌組織NLRP3 蛋白表達 采用免疫印跡法測定心肌組織NLRP3 炎癥蛋白表達。以裂解液裂解心肌組織，提取心肌組織蛋白。采用Bradford 法測定心肌組織的總蛋白含量。等量上樣，在12%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。以電轉膜方法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，考馬斯亮藍染色，觀察轉移效果后洗脫。用含5%脫脂奶粉的TBS 緩沖液封閉過夜。兔抗大鼠NLRP3 單克隆抗體進行免疫反應，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，DAB 顯色。結果在圖像系統(tǒng)中進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0 軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二維超聲心動圖參數(shù)比較 UBM 測量對照組、肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠二維超聲指標左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、LVEF、心率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組小鼠常規(guī)超聲指標比較（ ±s）

表1 各組小鼠常規(guī)超聲指標比較（ ±s）

注：LVEDD 為左心室舒張末期內徑，LVESD 為左心室收縮末期內徑，IVSd 為室間隔厚度，LVPWd 為左心室后壁厚度，LVEF為左心室射血分數(shù)

測量指標肥胖組肥胖+慢病毒空載體組肥胖+NLRP3-siRNA 組對照組F 值P 值LVEDD（mm） 3.36±0.20 3.60±0.06 3.48±0.10 3.41±0.10 0.965 >0.05 LVESD（mm）2.44±1.15 2.55±0.05 2.44±0.10 2.40±0.10 1.721>0.05 IVSd（mm） 0.79±0.05 0.78±0.04 0.71±0.02 0.64±0.02 5.532 <0.05 LVPWd（mm）0.63±0.11 0.70±0.22 0.76±0.15 0.71±0.16 2.112>0.05 LVEF（%） 48.76±3.79 53.90±2.04 56.00±2.41 58.80±1.97 1.943 >0.05心率（次/min）441.90±9.40 458.00±15.44 425.40±23.20 445.70±10.81 0.575>0.05 E/A 1.71±0.28 1.70±0.60 2.02±0.68 1.67±0.34 2.137 >0.05

2.2 應變參數(shù)比較 UBM 顯示對照組、肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠縱向應變及圓周應變組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組小鼠縱向應變參數(shù)明顯低于對照組及肥胖+NLRP3-siRNA 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組小鼠心外膜應變參數(shù)比較（ ±s）

表2 各組小鼠心外膜應變參數(shù)比較（ ±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與肥胖+NLRP3-siRNA 組比較，#P<0.05

參數(shù)對照組肥胖組肥胖+慢病毒空載組肥胖+NLRP3-siRNA 組F 值P 值縱向應變 22.04±2.89 7.35±1.37*# 11.06±1.22*# 17.11±3.10 7.168 <0.05徑向應變23.49±3.08 16.00±2.11 16.56±1.91 20.90±2.14 2.264>0.05圓周應變 20.10±2.00 29.84±2.67 23.71±1.68 23.27±2.48 3.018 <0.05

2.3 NLRP3 蛋白水平比較 Western blot 顯示對照組及肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠的NLRP3 蛋白表達條帶明顯減低（圖1）。

3 討論

C57BL/6 小鼠是目前食物誘導肥胖代謝性疾病研究中常用的動物模型。肥胖C57BL/6 小鼠隨周齡增長可自然發(fā)生肥胖相關代謝異常所致心肌損傷，如無干預可發(fā)展至心力衰竭，與肥胖人群的心肌發(fā)展規(guī)律非常相似[3]。然而小鼠心率快、體積小，臨床所用的高頻超聲分辨力不理想。因此，準確評估小鼠的心功能影像檢查比較困難。UBM 是一種無創(chuàng)、實時、活體、動態(tài)研究小動物微小結構形態(tài)及功能評價的方法，分辨率達30 μm，圖像與組織切片具有高度相關性，可清晰顯示小鼠的心臟及大血管等微小結構和多普勒血流信息，并進行精確定量檢測以及連續(xù)動態(tài)觀察[4]。因此，本實驗選擇UBM 觀察和測量肥胖小鼠的左心室結構及功能具有良好的可行性。應變及應變率顯像是UBM 中檢測心肌功能的新技術[5]。心肌應變指心肌在心動周期中發(fā)生的變形，可用于評價局部心肌的收縮功能與舒張功能、血供情況及心肌活力等[6]。應變及應變率顯像可定性及定量地顯示心肌收縮功能，為研究心臟整體和部分力學運動提供了嶄新的定量方法。該方法無角度依賴，且?guī)l較高。因此，本實驗應用UBM 定量分析肥胖小鼠模型心肌收縮力學特征。

肥胖誘導的心肌重構是指心肌結構、功能和表型的改變，包括心室質量、體積或形態(tài)改變，纖維化含量增加，細胞肥大和細胞死亡等[7]。當機體肥胖時，脂質過度沉積于白色脂肪組織中，使其功能受損，減少了脂肪因子的分泌；同時心外膜和其他內臟的脂肪組織釋放TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎性因子至循環(huán)系統(tǒng)，從而可能導致全身炎癥。系統(tǒng)性炎癥促進心外膜脂肪組織的積累以及進一步的局部和全身炎癥誘導終末器官功能障礙[8]。本研究結果顯示，肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組較對照組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠室間隔厚度增大，在肥胖小鼠早期室間隔代償性增厚，心臟代償作用下心肌環(huán)向收縮功能增強。因此，肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組較對照組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠圓周應變增加；而肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組較對照組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠縱向應變減低，提示肥胖小鼠心臟形態(tài)學發(fā)生早期改變，心肌收縮力減低，提示肥胖早期心肌出現(xiàn)損傷，心臟結構已發(fā)生重構。NLRP3 炎癥小體是胞內模式識別受體NLR 家族成員之一，參與炎癥反應[9-10]。NLRP3 炎癥小體的激活是脂質蓄積誘導肥胖發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，堆積的脂肪組織釋放炎癥介質進入循環(huán)系統(tǒng)可以引起心肌重構。本研究前期應用應變技術觀察到肥胖小鼠存在心肌早期收縮功能降低。Aloysius 等[11]在心肌梗死模型小鼠發(fā)現(xiàn)使用siRNA 或藥物抑制NLRP3 和P2X7 受體將使炎癥小體活化受到抑制。結果發(fā)現(xiàn)心肌細胞死亡減少，最終減輕心肌重構。因此，本研究采用Western Blot 檢測炎癥標志物NLRP3 的蛋白表達水平，結果顯示NLRP3 蛋白在肥胖+NLRP3-siRNA 組及對照組的表達水平顯著減低，與上述研究結果一致，表明應用NLRP3-siRNA 可以明顯改善肥胖小鼠的心肌炎癥，提示NLRP3 炎癥小體可能成為干預肥胖心肌早期損害發(fā)生及發(fā)展的重要靶標，有必要進一步探討其調控肥胖心肌損傷的分子機制。

圖1 NLRP3 各組蛋白水平比較。1 為對照組，2 為肥胖模型組，3 為肥胖+慢病毒空載體組，4 為肥胖+NLRP3-siRNA 慢病毒組

總之，UBM 可監(jiān)測肥胖小鼠的心肌收縮功能改變情況，應變值可作為評估肥胖心肌收縮功能改變的一個準確和有效的指標，血清NLRP3 炎癥因子與肥胖心肌早期損傷有關。