李 娜 喬宏萍 劉 地 李 博 武曉英 李曉君

(太原師范學(xué)院1，晉中 030619) (中北大學(xué)2，太原 030003)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)，又稱(chēng)大桂、牡桂、菌桂和中國(guó)桂等，屬雙子葉樟科喬木[1]。桂皮是肉桂干燥的樹(shù)皮，常被用于傳統(tǒng)中藥、食品香料以及烹飪調(diào)料等[2，3]。肉桂精油廣泛存在于肉桂的花、葉、果實(shí)和樹(shù)皮等器官中[4]。肉桂精油是一種具有揮發(fā)屬性的油，顏色可從黃色到紅棕色[5]。肉桂精油不僅能擴(kuò)張末稍血管、促進(jìn)血液循環(huán)流動(dòng)，還有助于強(qiáng)化消化道的排氣功能，避免體內(nèi)的腸胃發(fā)生痙攣，同時(shí)也有助于強(qiáng)化腸胃的消化功能[6]。另外，肉桂精油還具有促進(jìn)胰腺分泌胰島素的功能，并且可以清除血液中已經(jīng)受損的膽固醇，不但可以在某種程度上降低血糖和血脂在人體內(nèi)的含量[7，8]，而且其本身所具有食療效果還可以在一定程度上預(yù)防癌癥的發(fā)生[9]。

肉桂精油的組成成分有很多，其中主要包含了萜類(lèi)、芳香族小分子化合物、脂肪族小分子化合物、木脂素類(lèi)以及多糖類(lèi)等[10-12]。佘世望等[13]通過(guò)對(duì)包括肉桂在內(nèi)的60多種植物的抗氧化性比較分析，說(shuō)明這60多種植物的抗氧化活性強(qiáng)弱的數(shù)據(jù)。Wang等[14]利用濾紙片法和二倍稀釋法測(cè)定肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果表明肉桂精油對(duì)兩種菌均有抑制作用，但對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌能力明顯優(yōu)于成團(tuán)泛菌。郭新春等[15]通過(guò)對(duì)20種不同的植物材料的比較和研究，結(jié)果表明這20種植物中肉桂和牡丹皮的抑菌活性比較好，抑菌效果最為明顯。顧仁勇等[16]通過(guò)肉桂的抑菌試驗(yàn)研究，證明了肉桂精油不僅可以抑制細(xì)菌，還可以真菌和酵母菌，而且抑菌活性較強(qiáng)。因此，通過(guò)對(duì)肉桂精油的深入研究，為其在新型食品防腐劑、香科、抑菌劑和殺蟲(chóng)劑等[17]產(chǎn)業(yè)的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

目前，全世界都在密切關(guān)注食品的安全問(wèn)題，由于許多天然植物資源具有無(wú)毒、抗氧化性強(qiáng)的等優(yōu)點(diǎn)[18]，不斷擴(kuò)大的食品添加劑及香料市場(chǎng)也逐步將注意力從傳統(tǒng)的化學(xué)合成產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到天然植物產(chǎn)品上，而植物精油作為一種天然無(wú)毒的植物次生代謝產(chǎn)物而應(yīng)用到食品添加劑領(lǐng)域?qū)⒊蔀榭赡?。因此，?duì)天然植物精油在抗氧化和抑菌等方面的研究成為了熱點(diǎn)。本課題以肉桂精油為研究對(duì)象，通過(guò)GC-MS定性及定量研究其組成成分，并對(duì)其體外抗氧化性及抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，為開(kāi)發(fā)應(yīng)用新型抗氧化劑和抗菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肉桂；正己烷：色譜純；DPPH、ABTS：分析純。

供試菌株：大腸桿菌(EscherichiacoilCGMCC 44568)、金黃色葡萄球菌(StaphylococusaureusCGMCC 26085)均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心

Trace 1300/ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾提取肉桂精油

將肉桂干燥粉碎，將過(guò)80目篩的肉桂粉末置于燒瓶中，按料液比1∶10加入蒸餾水進(jìn)行提取，精油提取的時(shí)間為5 h，提取溫度100 ℃。收集精油，測(cè)定肉桂精油的提取率。

1.2.2 精油提取率測(cè)定

以一定質(zhì)量肉桂粉碎物提取所得精油的質(zhì)量來(lái)衡量精油提取率。按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.3 肉桂精油組成成分GC-MS檢測(cè)

采用Trace 1300系列氣相色譜與ISQ單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(thermo fisher scientific USA)相連，與氣相色譜連接的柱子為T(mén)R-5MS毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)。檢測(cè)升溫程序?yàn)椋涸?5 ℃的溫度下持續(xù)3 min，以3 ℃/min的速率將溫度從55 ℃升至250 ℃，然后在這個(gè)溫度下保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；載氣調(diào)整為流速是1 mL/min的氦氣。精油在處理后用色譜純正己烷稀釋?zhuān)M(jìn)樣量1 μL，分流比5∶1。測(cè)定精油成分所需的質(zhì)譜條件為：電子轟擊源，其電離能量70 eV，電子電離質(zhì)譜范圍33～550m/z。

1.2.4 肉桂精油抗氧化性測(cè)定[19]

1.2.4.1 DPPH·清除能力測(cè)定

將肉桂精油稀釋至不同濃度，每個(gè)濃度的肉桂精油樣品取0.3 mL加入試管中，于每個(gè)試管中分別加入體積為2.7 mL 濃度為60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，于518 nm處測(cè)定溶液的吸光度值。以含有0.3 mL的去離子水和2.7 mL 的DPPH溶液作為A0測(cè)定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL 的DPPH溶液作為As測(cè)定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL 的無(wú)水甲醇溶液作為Ar測(cè)定其吸光度值，用無(wú)水甲醇溶液作為測(cè)定吸光度值過(guò)程中的空白對(duì)照，用BHT作為實(shí)驗(yàn)測(cè)定過(guò)程中的陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)式(2)計(jì)算肉桂精油對(duì)DPPH·的清除率。

(2)

式中：I為肉桂精油對(duì)DPPH·的清除率/%；A0為DPPH溶液加去離子水作為空白對(duì)照的吸光度值；As為肉桂精油樣品溶液與DPPH溶液進(jìn)行反應(yīng)后的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS·清除能力測(cè)定

分別配制濃度為7 mmol/L的 ABTS溶液和濃度為2.5 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，將二者等體積混合，在室溫的條件下避光反應(yīng)12～16 h，獲得ABTS工作液。測(cè)定前用80%的乙醇溶液將ABTS工作液進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊湓?34 nm波長(zhǎng)處的吸光度值維持在0.7±0.02。將肉桂精油樣品稀釋為不同的濃度，每個(gè)濃度的精油樣品取0.3 mL加入試管中，分別加入2.7 mL ABTS工作液于輕輕振蕩使其均勻地混合，室溫避光進(jìn)行反應(yīng)30 min，于734 nm處測(cè)定溶液的吸光度值，以含有0.3 mL的去離子水和2.7 mL 的ABTS工作液作為為A0測(cè)定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL的ABTS工作液作為As測(cè)定其吸光度值，以含有0.3 mL的肉桂精油樣品溶液和2.7 mL 的無(wú)水乙醇溶液作為Ar測(cè)定其吸光度值，用無(wú)水乙醇溶液作為空白對(duì)照，以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)式(3)計(jì)算肉桂精油對(duì)ABTS·的清除率。

(3)

式中：I為肉桂精油對(duì)ABTS·的清除率/%；A0為ABTS溶液加去離子水作為空白對(duì)照的吸光度值；As為樣品溶液與ABTS溶液進(jìn)行反應(yīng)后的吸光度值。

1.2.5 肉桂精油抑菌活性測(cè)定

1.2.5.1 抑菌圈測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定肉桂精油抑菌圈直徑[20]。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種的活化培養(yǎng)，然后用無(wú)菌的生理鹽水稀釋配成菌懸液，使溶液的含菌數(shù)大約為106cfu/mL，搖勻。在無(wú)菌環(huán)境下，量取100 μL不同供試菌種稀釋后的菌懸液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，制成含菌平板。在每個(gè)含菌平板中等距放置3個(gè)已滅菌的直徑為6 mm的圓濾紙片，1個(gè)滴加5 μL的陽(yáng)性對(duì)照液，另2個(gè)滴加各5 μL的肉桂精油，37 ℃倒置培養(yǎng) 24 h后測(cè)定肉桂精油對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌圈的直徑大小。

注：圖中峰上標(biāo)的阿拉伯?dāng)?shù)字表示GC-MS所檢測(cè)到的化合物峰編號(hào)。圖1 肉桂精油總離子流圖

1.2.5.2 MIC和MBC測(cè)定

用微量稀釋法測(cè)定精油的MIC和MBC值[21]。將供試菌菌懸液與精油溶液置于96孔板孔內(nèi)，使其精油濃度為0.125～8 mg/mL，并置于37 ℃培養(yǎng)24 h。以含有氨芐西林為對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油的提取率

經(jīng)過(guò)多次反復(fù)提取，肉桂精油的提取率為1.34%，比文獻(xiàn)報(bào)道的桂皮精油提取率低[22-24]?？赡苁怯捎谌夤鹁透邷啬褪苄暂^差，因此受提取時(shí)間的影響，提取時(shí)間過(guò)短，會(huì)導(dǎo)致肉桂精油的提取不完全；提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，肉桂精油在高溫下長(zhǎng)時(shí)間受熱，自身會(huì)被氧化，造成有效成分的損失，導(dǎo)致提取率降低。

表1 肉桂精油的提取率

2.2 肉桂精油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析

采用GC-FID和GC-MS (圖1)對(duì)不同肉桂品種的水蒸餾精油的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。由表可知，GC-MS共鑒定出38種肉桂精油化合物，占肉桂精油總質(zhì)量的 99.59%，其中相對(duì)含量較多的組分為反式-肉桂醛(59.54%)，γ-松油烯(12.90%)，葎草烯(6.58%)，石竹烯(4.22%)，β-紅沒(méi)藥烯(2.20%)，視黃醇乙酸酯(1.70%)。肉桂精油不僅包括醛類(lèi)化合物，烯烴和酯，還包括了醇類(lèi)和酮類(lèi)等化合物，其中醛類(lèi)含量為主要成分，約占總質(zhì)量的60.12%，烯烴類(lèi)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.78%，醇類(lèi)化合物的為2.69%，酯類(lèi)化合物的為2.61%，酮類(lèi)化合物的為1.39%。本研究結(jié)果與Li等[3]，Chairunnisa等[11], Deng等[4]的研究結(jié)果一致，所鑒定的肉桂精油主要成分都是反式肉桂醛，與Aneta等[25]測(cè)定的肉桂精油主要成分是芳樟醇Linalool的研究結(jié)果不同，導(dǎo)致肉桂精油化學(xué)組成不同的主要原因可能是肉桂基因型的不同，同時(shí)，土壤、氣候等其他因素也可能是肉桂精油組成成分不同的原因。

表2 肉桂精油主要成分

2.3 肉桂精油的抗氧化性分析

2.3.1 肉桂精油對(duì)DPPH·的清除能力

肉桂精油和BHT對(duì)DPPH·的清除率如圖2所示。由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，肉桂精油對(duì)DPPH·具有清除能力，當(dāng)質(zhì)量濃度低于250 μg/mL時(shí)，肉桂精油對(duì)DPPH·的清除率隨精油濃度的增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度高于250 μg/mL時(shí)，肉桂精油對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度的增大逐漸趨于穩(wěn)定，肉桂精油對(duì)DPPH·的清除能力的IC50值是96.918 9μg/mL，其最大的清除率可達(dá)76.51%；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，BHT對(duì)DPPH·具有清除能力，且其清除率隨著B(niǎo)HT濃度的增大而先提高后逐漸趨于不變，BHT對(duì)DPPH·的清除能力的IC50值為4.095 5 μg/mL，其最大清除率高達(dá)95.89%。通過(guò)對(duì)比肉桂精油和BHT這兩種不同抗氧化劑對(duì)DPPH·的清除作用可知，天然肉桂精油對(duì)DPPH·的清除效果明顯弱于化學(xué)合成的抗氧化劑BHT。

圖2 肉桂精油和BHT對(duì)DPPH·的清除能力

2.3.2 肉桂精油對(duì)ABTS·的清除能力

肉桂精油和BHT對(duì)ABTS·的清除率如圖3所示。由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，肉桂精油樣品對(duì)ABTS·具有清除能力，且肉桂精油對(duì)ABTS·的清除率與精油樣品的濃度之間存在量效關(guān)系。當(dāng)精油質(zhì)量濃度低于30 μg/mL時(shí)，肉桂精油對(duì)ABTS·的清除率隨著肉桂精油樣品濃度的升高而顯著增大，而在質(zhì)量濃度高于30 μg/mL時(shí)，肉桂精油樣品對(duì)ABTS·的清除率隨著肉桂精油樣品濃度的提高逐漸趨于穩(wěn)定，肉桂精油對(duì)ABTS·的清除能力的IC50值是6.366 9 μg/mL，其最大清除率可達(dá)99.8%；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，BHT對(duì)ABTS·具有較強(qiáng)清除能力，BHT對(duì)ABTS·的清除能力的IC50值是1.359 6 μg/mL，其最大清除率可達(dá)96.23%。對(duì)比肉桂精油樣品與BHT的清除能力可知，肉桂精油樣品對(duì)ABTS·的清除效果弱于BHT。

圖3 肉桂精油和BHT對(duì)ABTS·的清除

2.4 肉桂精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性

肉桂精油對(duì)大腸桿菌(a)與金黃色葡萄球菌(b)的抑菌效果如圖4所示。肉桂精油對(duì)不同供試菌表現(xiàn)出不同的細(xì)菌敏感性。肉桂精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，分別形成了直徑為16、19 mm的抑菌圈，本結(jié)果與Cui等[26]的研究結(jié)果一致，都證明肉桂精油對(duì)革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌在短期內(nèi)都有抑制作用。因此，肉桂精油對(duì)這兩種細(xì)菌都有比較強(qiáng)抑制性，可被用在食品防腐保鮮領(lǐng)域。

圖4 肉桂精油對(duì)大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的抑菌圈

表3和表4顯示了在體外培養(yǎng)條件下獲得的肉桂精油的最小抑菌濃度值。結(jié)果表明，肉桂油抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的最低劑量(MIC)分別為0.50、0.25 mg/mL，化學(xué)合成氨芐西林對(duì)兩種菌的MIC值僅為0.031 25 mg/mL 。MIC值越低，抗菌活性越強(qiáng)。肉桂油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用要比大腸桿菌強(qiáng)，這表明肉桂油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制活性高于革蘭氏陰性菌。

表3 牛至精油對(duì)大腸桿菌的MIC值/mg/mL

表4 牛至精油對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值/mg/mL

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取肉桂精油，提取率為1.34%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)任何化學(xué)試劑，無(wú)污染，節(jié)能環(huán)保。GC-MS共鑒定分析出38種肉桂精油組成成分，占肉桂精油總質(zhì)量的99.59%，包括烴烯、酯、醇、醛和酮等多種化合物，其中醛類(lèi)化合物含量為主要成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.12%，烯烴類(lèi)的化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.78%，醇類(lèi)的化合物的為2.69%，酯類(lèi)化合物的為2.61%，酮類(lèi)化合物的為1.39%。肉桂精油中相對(duì)含量較多的為反式-肉桂醛(59.54%)γ-松油烯(12.90%)，葎草烯(6.58%)、石竹烯(4.22%)。肉桂精油對(duì)DPPH·和ABTS·均有清除作用，且清除能力的強(qiáng)弱與肉桂精油濃度之間存在量效關(guān)系，肉桂精油對(duì)ABTS·清除的能力強(qiáng)于對(duì)DPPH·清除的能力，其IC50值分別為96.918 9、6.366 9 μg/mL。肉桂精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，其抑菌圈直徑分別為16、19 mm，屬高度敏感。