桐廬縣中醫(yī)院 浙江 桐廬 311500

本實驗通過觀察附子湯對三種不同病因病機的骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型體重及軟骨病理變化，檢測不同時間點血清、關(guān)節(jié)液、軟骨組織及滑膜中白細胞介素-1β（IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶4（ADAMTS4）和血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶5（ADAMTS5）水平的變化，探討附子湯治療OA的可能機制，揭示中藥對證施治的科學意義，為OA的中醫(yī)臨床治療和附子湯的二次開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：健康SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200±20g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度22±2oC，濕度50%～60%，14h光照和10h黑暗的環(huán)境明暗交替，換風次數(shù)15～20次/小時。由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心飼養(yǎng)。實驗飼養(yǎng)室許可證號：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 實驗藥物、試劑及儀器：附子湯由制附子、白術(shù)各12g，茯苓、白芍各9g，人參6g等藥組成。加水提取2次，每次1.5h，減壓濃縮至2g生藥/ml的藥液，備用。大鼠MMP-13 ELISA試劑盒（武漢酶免公司），大鼠ADAMTS4、ADAMTS5 ELISA試劑盒（LifeSpan Biosciences公司）；Trizol（生工生物）；SYBR Green qPCR試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀）；酶標儀（MD公司），低速離心機（Thermo Scientific），普通PCR儀（Eppendorf公司），核酸定量儀（Thermo Scientific），qPCR儀（羅氏公司）。

1.3 動物造模：①寒濕痹阻OA模型：根據(jù)其平均膝關(guān)節(jié)大小設(shè)計可固定的雙層金屬關(guān)節(jié)套管，套管夾層可放入碎冰和水，對每只鼠膝關(guān)節(jié)進行束縛冰浴，每天早晚各1次，每次2h，持續(xù)12周。②機械損傷OA模型：采用改良的Hulth韌帶/半月板損傷方法[1]，SD大鼠常規(guī)剪毛、消毒，采用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉；無菌條件下，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，充分顯露膝關(guān)節(jié)，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板；術(shù)后3d給予80萬單位青霉素肌肉注射。③化學損傷OA模型：采用經(jīng)典的碘乙酸關(guān)節(jié)腔注射方法[2]，SD大鼠在無菌條件下，10%水合氯醛腹腔注射（0.3ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠仰臥位固定于操作臺，剃須刀剃除雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍絨毛，用酒精棉球擦拭2遍，術(shù)者微屈大鼠膝關(guān)節(jié)以微量注射器由髕骨內(nèi)側(cè)下方斜上刺入關(guān)節(jié)腔，膝關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鹽50μl。

1.4 分組：造模成功后，將每種模型存活的大鼠隨機分為寒濕痹阻OA組、寒濕痹阻附子湯組、機械損傷OA組、機械損傷附子湯組、化學損傷OA組、化學損傷附子湯組，每組6只，另有6只作為正常組。

1.5 給藥方式：SD大鼠給藥劑量按人和動物藥物等效劑量換算公式計算，寒濕痹阻附子湯組、機械損傷附子湯組、化學損傷附子湯組給予計算后的附子湯水煎濃縮液灌胃，正常組、寒濕痹阻OA組、機械損傷OA組、化學損傷OA組給予等劑量生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃12周。

1.6 觀察指標：分述如下。

1.6.1 各組大鼠一般情況觀察：造模后當天稱一次體質(zhì)量，之后每兩周的早晨9：00稱量大鼠的體質(zhì)量，觀察各組大鼠體征變化并做記錄，維持12周，共記錄7次。

1.6.2 病理組織染色：將分離的右膝關(guān)節(jié)用4%多聚甲醛固定1d，進行脫鈣脫水，然后包埋石蠟。對12周大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨進行組織病理染色，并用顯微鏡觀察拍照。軟骨的退變情況根據(jù)國際骨關(guān)節(jié)炎研究學會(OARSI)評分進行分級。

1.6.3 ELISA法檢測12周大鼠血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5水平：大鼠取血后，3500r/min離心15min，取上清，將所得的血清放入－80℃冰箱待測MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5水平；處死動物前，在雙膝關(guān)節(jié)腔中注入生理鹽水500μl并混勻，然后再抽取關(guān)節(jié)液，離心取上清液，置于－80℃待檢測MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5水平。

1.6.4 qRT-PCR檢測大鼠軟骨組織及滑膜組織中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平：取各組另一側(cè)關(guān)節(jié)軟骨組織及滑膜組織50mg，液氮研磨組織，以Trizol法提取總RNA，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，總反應(yīng)體系20μl，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系20μl。以qRT-PCR技術(shù)檢測MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平情況，反應(yīng)條件：95℃，10min變性；95℃，15s；60℃，60s；40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，得出CT值，運用2-△△Ct法計算基因相對表達量。qRT-PCR所用引物序列信息如表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。組間兩兩比較，方差齊性者采用獨立樣本t檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體征變化情況：造模前所有大鼠均正常進食飲水，反應(yīng)靈活，毛色光亮，排泄正常。造模后除正常組外其他各組大鼠均出現(xiàn)精神狀況欠佳，活動量減少的現(xiàn)象，部分大鼠手術(shù)部位出現(xiàn)變紅、腫脹。給藥后各組大鼠癥狀均見不同程度的改善，取材時各組大鼠的表現(xiàn)已無明顯差異，均能正常飲食水，活動自如，狀態(tài)較好。

由表2中可知，與正常組相比，寒濕痹阻OA組、機械損傷OA組和化學損傷OA組大鼠的體質(zhì)量顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01或P＜0.05）；與寒濕痹阻OA組相比，寒濕痹阻附子湯組大鼠的體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；與機械損傷OA組相比，機械損傷附子湯組大鼠的體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；與化學損傷OA組相比，化學損傷附子湯組大鼠的體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表2 大鼠給藥后12周不同時間點體質(zhì)量變化（±s，g，n=6）

表2 大鼠給藥后12周不同時間點體質(zhì)量變化（±s，g，n=6）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別正常組寒濕痹阻OA組寒濕痹阻附子湯組機械損傷OA組機械損傷附子湯組化學損傷OA組化學損傷附子湯組12周324.15±15.03 288.72±12.73▲▲294.93±12.14 263.55±11.95▲▲271.58±15.45 272.42±10.95▲▲275.28±9.14 0周277.28±11.10 255.68±14.59▲256.87±7.97 243.07±10.11▲▲256.72±15.34 247.32±15.76▲▲255.57±10.27 2周283.77±14.67 260.15±12.97▲262.30±11.32 246.67±11.60▲▲248.47±15.66 250.80± 9.50▲▲253.72±9.06 4周293.03±15.86 264.63±12.84▲267.18±11.67 248.47±11.93▲▲255.55±15.30 254.03± 9.21▲▲256.80±8.92 6周301.05±16.32 275.47±12.80▲279.88±11.86 257.20±11.97▲▲264.47±15.55 262.12± 9.33▲▲264.97±8.92 8周311.07±14.91 279.92±12.69▲▲284.68±12.12 259.25±11.99▲▲266.73±15.46 266.25± 9.67▲▲268.48±9.20 10周317.93±15.08 283.77±12.67▲▲290.05±12.18 261.68±11.86▲▲269.50±15.51 269.52±10.90▲▲272.20±9.06

2.2 關(guān)節(jié)軟骨病理學觀察：由圖1可知，正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色可見表層光滑、平整，軟骨細胞分布均勻，序列整齊，層次清楚，無簇集軟骨細胞，潮線完整；基質(zhì)染色無失染。寒濕痹阻OA組、機械損傷OA組和化學損傷OA組模型大鼠軟骨組織以中-重度損傷為主，可見軟骨表層纖維化，有裂隙深達中間層；軟骨細胞排列紊亂，細胞簇擁現(xiàn)象增多。基質(zhì)染色中-重度減少，潮線不規(guī)則，甚至被血管破壞。各給藥組大鼠軟骨組織病理均有不同程度改善，軟骨表層不平整，無裂隙，細胞排列紊亂，基質(zhì)染色輕度或中度減少，潮線不規(guī)則，可見部分潮線完整性受到破壞。

2.3 12周后大鼠血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量水平：由表3、表4可知，經(jīng)過12周后，與正常組相比，寒濕痹阻OA組、機械損傷OA組和化學損傷OA組血清及關(guān)節(jié)液中的MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量均顯著升高（P＜0.01）；與寒濕痹阻OA組相比，寒濕痹阻附子湯組血清及關(guān)節(jié)液中的MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量均顯著降低（P＜0.01）；與機械損傷OA組相比，機械損傷附子湯組血清及關(guān)節(jié)液中的MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量均顯著降低（P＜0.05）；與化學損傷OA組相比，化學損傷附子湯組血清及關(guān)節(jié)液中的MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量均顯著降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨HE染色

表3 12周后大鼠血清中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量水平（±s，n=6）

表3 12周后大鼠血清中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量水平（±s，n=6）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與對應(yīng)OA組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別正常組寒濕痹阻OA組寒濕痹阻附子湯組機械損傷OA組機械損傷附子湯組化學損傷OA組化學損傷附子湯組ADAMTS5（μg/L）5.09±0.46 36.99±3.05▲▲25.17±2.33★★39.26±3.19▲▲34.97±2.72★41.70±3.87▲▲36.06±3.23★IL-1β（pg/ml）4.52±0.38 17.05±1.41▲▲12.13±1.17★★17.31±1.26▲▲15.13±1.50★18.00±1.34▲▲16.21±1.24★MMP-13（μg/L）26.28±2.35 95.77±7.59▲▲66.25±5.58★★97.94±8.32▲▲86.38±8.02★105.68±9.33▲▲92.95±8.43★ADAMTS4（μg/L）7.92±0.74 60.58±5.45▲▲39.96±3.75★★61.39±5.88▲▲51.92±5.06★64.88±5.49▲▲58.02±4.99★

表4 12周后大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量水平（±s，n=6）

表4 12周后大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5含量水平（±s，n=6）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與對應(yīng)OA組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別正常組寒濕痹阻OA組寒濕痹阻附子湯組機械損傷OA組機械損傷附子湯組化學損傷OA組化學損傷附子湯組ADAMTS5（μg/L）5.09±0.46 36.99±3.05▲▲25.17±2.33★★39.26±3.19▲▲34.97±2.72★41.70±3.87▲▲36.06±3.23★IL-1β（pg/ml）12.45±1.67 39.82±2.73▲▲25.09±1.71★★42.74±3.15▲▲37.95±2.68★44.73±3.70▲▲39.70±2.72★MMP-13（μg/L）30.27±2.98 120.89± 8.49▲▲88.55± 7.00★★123.35± 8.52▲▲109.92± 7.79★130.65±10.67▲▲115.77± 8.08★ADAMTS4（μg/L）18.19±1.76 56.96±4.29▲▲41.15±3.61★★57.12±4.48▲▲50.36±3.87★60.68±5.37▲▲54.15±3.95★

2.4 大鼠軟骨組織及滑膜組織中IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平：由表5、表6可知，與正常組相比，寒濕痹阻OA組、機械損傷OA組和化學損傷OA組軟骨組織及滑膜組織中MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與寒濕痹阻OA組相比，寒濕痹阻附子湯組軟骨組織及滑膜組織中MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與機械損傷OA組相比，機械損傷附子湯組軟骨組織及滑膜組織中MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與化學損傷OA組相比，化學損傷附子湯組軟骨組織中MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

表5 12周后大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達情況（±s，n=3）

表5 12周后大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達情況（±s，n=3）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與對應(yīng)OA組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別正常組寒濕痹阻OA組寒濕痹阻附子湯組機械損傷OA組機械損傷附子湯組化學損傷OA組化學損傷附子湯組ADAMTS5 1.00±0.10 1.90±0.22▲▲1.13±0.11★★2.11±0.28▲▲1.35±0.11★2.14±0.28▲▲1.39±0.11★IL-1β 1.00±0.11 1.82±0.17▲▲1.24±0.12★★2.11±0.31▲▲1.56±0.10★2.15±0.29▲▲1.59±0.13★MMP-13 1.00±0.10 1.59±0.15▲▲1.10±0.11★★1.78±0.26▲▲1.23±0.08★1.81±0.24▲▲1.10±0.30★ADAMTS4 1.00±0.10 1.77±0.18▲▲1.19±0.11★★2.12±0.26▲▲1.45±0.07★1.98±0.22▲▲1.37±0.09★

表6 12周后大鼠滑膜組織IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達情況（±s,n=3）

表6 12周后大鼠滑膜組織IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達情況（±s,n=3）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與對應(yīng)OA組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別正常組寒濕痹阻OA組寒濕痹阻附子湯組機械損傷OA組機械損傷附子湯組化學損傷OA組化學損傷附子湯組IL-1β 1.01±0.12 1.92±0.17▲▲1.28±0.13★★2.25±0.33▲▲1.59±0.10★2.30±0.28▲▲1.59±0.16★MMP-13 1.00±0.10 1.63±0.15▲▲1.16±0.08★★1.93±0.27▲▲1.24±0.10★1.94±0.18▲▲1.49±0.11★ADAMTS4 1.00±0.11 1.82±0.22▲▲1.12±0.10★★2.10±0.29▲▲1.36±0.11★2.01±0.27▲▲1.32±0.12★ADAMTS5 1.00±0.11 2.00±0.20▲▲1.15±0.08★★2.23±0.30▲▲1.25±0.10★2.14±0.29▲▲1.57±0.14★

3 討論

中醫(yī)學根據(jù)骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀、病變部位等，將其歸為“歷節(jié)”“骨痹”等范疇，寒濕痹阻證為常見的證型。該病的主要病因病機為肝脾腎不足，氣血虧虛，外感風寒濕邪，痰凝血瘀。中醫(yī)學采用辨證論治和標本同治的原則，以扶正補虛和祛邪化瘀相結(jié)合的辦法來改善關(guān)節(jié)軟骨的損傷及退變。附子湯出自《傷寒雜病論》，是治療寒濕痹阻證的方劑，主治陽虛有寒導致的關(guān)節(jié)疼痛，具有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨代謝的作用。臨床研究表明附子湯可有效減輕輕中度骨關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證患者的膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，且不良反應(yīng)較少。但其作用機制不十分清楚。

本實驗選用附子湯治療三種不同病因病機骨關(guān)節(jié)炎模型，其結(jié)果顯示附子湯能更有效改善寒濕痹阻型骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨病理結(jié)構(gòu)，降低血清、關(guān)節(jié)液、軟骨組織及滑膜組織中 IL-1β、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA水平。提示附子湯針對寒濕痹阻型病因病機，達到溫腎散寒、活血化瘀、祛濕止痛的作用。本研究為附子湯對臨床對癥治療提供了堅實的科學依據(jù)，以及利于進一步開發(fā)其功效和作用機制。