顧賽麒，胡彬超，張月婷，鮑嶸斌，王蘇寧，鄒琳，周緒霞，丁玉庭*，欒露琴，張晨超，唐文燕

1(寧?？h浙工大科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 寧海,3156001) 2(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州,310014) 3(國家遠洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州,310014)

海帶(Laminariajaponica)是我國重要的海水養(yǎng)殖品種，2018年全國養(yǎng)殖總量已達152.3萬 t[1]。海帶營養(yǎng)成分豐富，但自身腥味較重，對其食用品質(zhì)可能造成不利影響[2-3]。海帶腥味物質(zhì)主要包括醛類、醇類、烯酮類、有機溴代物或碘代物等[4-6]。目前，海帶脫腥方法可分為物理法、化學(xué)法和生物法[7]，其中生物法具有脫腥效率高、工藝條件溫和等優(yōu)點，應(yīng)用最為廣泛，具體機理是：在微生物的作用下，小分子的腥味物質(zhì)經(jīng)合成、轉(zhuǎn)化或結(jié)構(gòu)修飾等作用，最終成為無腥味成分。據(jù)報道，酵母菌是最常用的發(fā)酵菌種，其脫腥效果較好[8]。

在酵母法脫腥過程中，酵母濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等因素對海帶脫腥效果影響顯著。酵母菌初始濃度過低或者發(fā)酵時間過短，可能導(dǎo)致腥味物質(zhì)消降不完全；反之，則可能造成菌體大量增加，引入菌體異味而導(dǎo)致風(fēng)味品質(zhì)下降。此外，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)(H2CO3等)不斷積累，使發(fā)酵液pH顯著下降，影響酵母菌活性。同時，若發(fā)酵溫度過高或過低也會對酵母菌活性造成影響，進而影響最終脫腥效果[8]。

現(xiàn)階段對海帶脫腥的常用評價手段有感官評價、電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。感官評價能客觀反映消費者對樣品的接受度或喜好性，但易受人員因素的影響[9-10]。電子鼻可區(qū)分不同樣品氣味輪廓的細微差異，但無法對樣品中的某一揮發(fā)性成分進行鑒別[11-12]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是最常用的揮發(fā)性風(fēng)味分析手段，其結(jié)果與使用的前處理技術(shù)密切相關(guān)。整體材料吸附萃取作為一種逐漸興起的前處理技術(shù)，基于硅膠、活性炭和十八烷基硅烷等材料為一體的高交聯(lián)性新型吸附劑，對不同極性和沸點的化合物均能實現(xiàn)有效吸附，適用范圍較廣[13]。上述3種評價手段各有利弊，本研究嘗試將其聯(lián)用后優(yōu)化海帶發(fā)酵脫腥工藝，旨在為海帶制品生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，2017年3月購自杭州近江水產(chǎn)市場；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母(貨號：E80000012)，河南洲洋生物科技有限公司；葡萄糖、NaCl、無水乙醇(均為分析純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；2,4,6-三甲基吡啶標準品、C6～C15正構(gòu)烷烴標準品(均為色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA 3204B電子分析天平，上海儀天科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；LRH-350F生物培養(yǎng)箱，常州市金壇勒普儀器有限公司；RCC18固相萃取整體捕集劑(規(guī)格2.9 mm×5 mm，孔徑1 mm)，日本GL Sciences公司；7890A/5975C單四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；Fox4000型電子鼻，法國阿爾法莫斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫腥處理

酵母活化液制備：稱取10 g葡萄糖和0.3 g NaCl充分溶解于1 000 mL去離子水中，分別向其中加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g釀酒酵母干粉，配成質(zhì)量濃度梯度為0.5、1、1.5、2和2.5 g/L的酵母菌液，將上述系列菌液置于25 ℃、120 r/min的恒溫搖床中活化20 min，所得活化液中酵母菌數(shù)分別為7.86、8.14、8.32、8.46和8.56 lg CFU/g。

海帶脫腥工藝：將海帶剪成1 cm×1 cm左右、大小均一的小塊。稱取10 g海帶樣品，裝入內(nèi)裝100 mL酵母活化液的具塞錐形瓶中，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫搖床中，分別于不同溫度下(24、26、28、30和32 ℃)脫腥不同時間(30、60、90、120和150 min)。脫腥完畢的海帶洗凈后用吸水紙吸干表面，混合均勻后待測。

1.3.2 電子鼻分析

稱取2.00 g海帶樣品，裝入10 mL頂空瓶中，采用FOX4000型電子鼻進行測定。儀器參數(shù)：平衡溫度60 ℃，平衡時間600 s，進樣速度2 000 μL/s，進樣體積2 000 mL，載氣為潔凈空氣，流速150 mL/min，數(shù)據(jù)采集周期600 s。每個樣品重復(fù)測定5次。

1.3.3 整體材料吸附萃取-氣相-質(zhì)譜分析

稱取2.00 g海帶樣品，裝入15 mL頂空進樣瓶中。將5個RCC18空心圓柱體吸附子以固定裝置相連，置于頂空瓶中樣品正上方。將頂空瓶放入60 ℃恒溫水浴鍋中萃取50 min，待萃取完畢后手動取出吸附子裝入熱脫附管，送入熱解析單元中熱脫附進樣。每個樣品重復(fù)測定3次。

熱解析單元：不分流模式，初始溫度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。為防止進樣量較大引起的峰形變形，配制了液氮冷阱系統(tǒng)：初始溫度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留15 min。

GC條件：DB-5 MS毛細管柱(60 m×0.32 mm, 1 μm)，汽化室溫度240 ℃。柱溫起始40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。載氣流量1.2 mL/min。MS條件：EI能量源；電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z35～450，離子源溫度220 ℃，傳輸線溫度250 ℃。

定性、定量方法：將揮發(fā)物質(zhì)譜圖與NIST 2014譜庫進行比對，僅報道正反匹配度均>800的鑒定結(jié)果，同時計算各個揮發(fā)物的線性保留指數(shù)(linear retention index，LRI)，將其與文獻中的數(shù)值進行比對后定性[14]。在海帶樣品中加入10 μL質(zhì)量濃度為10-5g/mL的內(nèi)標物2, 4, 6-三甲基吡啶，通過計算待測揮發(fā)物與內(nèi)標物峰面積的比值來求得各揮發(fā)物的質(zhì)量濃度。

1.3.4 感官評價

采用劃線法[15]對海帶整體氣味可接受度進行評分。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件和Origin 8.0軟件進行處理分析，差異顯著性分析由最小顯著差數(shù)法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻技術(shù)分析不同發(fā)酵工藝對海帶腥味脫除的影響

圖1～圖3中第1與第2主成分貢獻度之和均>90%，表明經(jīng)不同條件發(fā)酵后，海帶樣品整體氣味輪廓差異均十分顯著，樣品信息損失率<10%。判別指數(shù)主要用于評定不同組樣品數(shù)據(jù)點間的區(qū)分程度，最大值為100，其值越大表明區(qū)分效果越好[8]。圖1～圖3判別指數(shù)均在84以上，表明經(jīng)不同發(fā)酵條件處理后，海帶樣品整體氣味輪廓均無重疊，區(qū)分度較好。

圖1 不同酵母濃度處理海帶樣品電子鼻結(jié)果 主成分分析圖Fig.1 PCA plot of E-nose results ofLaminaria japonica fermented with different yeast concentrations

圖1顯示，酵母質(zhì)量濃度分別在0.5、1 g/L以及1.5、2 g/L時，樣品數(shù)據(jù)點均較為接近；當(dāng)酵母質(zhì)量濃度達到2.5 g/L時，樣品數(shù)據(jù)點與其他濃度組間距離顯著增大，分析可能與酵母質(zhì)量濃度過高引入菌體異味有關(guān)。由圖2可知，發(fā)酵溫度在24～28 ℃時，樣品各組數(shù)據(jù)點間距離較為接近；而發(fā)酵溫度>30 ℃時，樣品數(shù)據(jù)點與其他組間距離不斷增大，表明過高的發(fā)酵溫度可能對脫腥后海帶樣品氣味產(chǎn)生不利影響。圖3顯示，隨著發(fā)酵時間的延長，樣品數(shù)據(jù)點與原料海帶數(shù)據(jù)點間距離不斷增大，推測海帶發(fā)酵過程中腥味物質(zhì)的脫除可能存在時間積累效應(yīng)。此外，通過比較各組樣品數(shù)據(jù)點與原料海帶數(shù)據(jù)點質(zhì)心間的平均距離，發(fā)現(xiàn)存在“酵母質(zhì)量濃度>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度”的趨勢，表明酵母質(zhì)量濃度可能對海帶脫腥效果存在最顯著的影響。

圖2 不同發(fā)酵溫度處理海帶樣品電子鼻結(jié)果 主成分分析圖Fig.2 PCA plot of E-nose results of Laminaria japonica fermented under different temperatures

圖3 不同發(fā)酵時間處理海帶樣品電子鼻結(jié)果 主成分分析圖Fig.3 PCA plot of E-nose results of Laminaria japonica with different fermentation time

2.2 不同發(fā)酵工藝對海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

2.2.1 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

從原料海帶中共檢測出42種化合物，其中氣味活度值(odor activity value,OAV)>1的化合物共有己醛等10種，可定義為海帶中的活性氣味物質(zhì)。經(jīng)不同發(fā)酵條件處理后，無論是揮發(fā)物種類、總濃度,還是OAV值總和均發(fā)生了不同幅度的下降。當(dāng)酵母質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，揮發(fā)物種類從原來的42種減少為25種，總質(zhì)量分數(shù)降低141.13 ng/g，OAV值總和降低36.96。當(dāng)酵母發(fā)酵溫度為28 ℃時，揮發(fā)物種類減少16種，總質(zhì)量分數(shù)和OAV總和降幅最大，分別為49%和40%。當(dāng)發(fā)酵時間為120 min時，共有18種揮發(fā)物被消除，揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)和OAV總和降至最低，分別為138.88 ng/g和52.68 ng/g。綜上所述，確定海帶發(fā)酵脫腥的最優(yōu)工藝條件為：酵母質(zhì)量濃度1.5 g/L、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間120 min。

醛類氣味閾值較低，對海帶整體氣味貢獻最為突出。經(jīng)最優(yōu)工藝發(fā)酵后，6種氣味活性醛類OAV值均發(fā)生了不同程度消降，其中己醛、庚醛和癸醛的消降程度較多，分別為18.77、4.30和4.62。己醛被報道是海帶的典型腥味物質(zhì)，呈魚腥味、青草味等不良氣味特征[16]。除己醛外，其他直鏈醛和含不飽和鍵的烯醛也被報道是海帶中的異味物質(zhì)，而苯甲醛具有苦杏仁味[17]，經(jīng)發(fā)酵后它們質(zhì)量分數(shù)和活性值均下降顯著。

醇類對海帶整體揮發(fā)性風(fēng)味有重要影響。經(jīng)最優(yōu)工藝發(fā)酵后，醇類總質(zhì)量分數(shù)和OAV值總和下降近50%，其中3種不飽和烯醇貢獻較顯著：1-戊烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的消降率達100%，而1-辛烯-3-醇被報道是海帶中典型的腥味物質(zhì)(呈魚腥味和青草味)[18]，發(fā)酵后其OAV消降值達3.51，占醇類消降量的46%。段吳勇[19]報道，酵母發(fā)酵后海帶中醇類物質(zhì)種類顯著減少、濃度大幅下降，與本研究結(jié)果一致。

酮類是海帶中常見的風(fēng)味組分，經(jīng)最優(yōu)工藝發(fā)酵后，2-庚酮、1-辛烯-3-酮、3-辛酮和苯乙酮這4種酮類被完全消除，占所有酮類總數(shù)的一半。1-辛烯-3-酮是原料海帶中濃度最高的酮類物質(zhì)，呈典型的魚腥味，有研究者證實海帶發(fā)酵后1-辛烯-3-酮的脫除率為100%[19]。原料海帶中僅有2-庚酮具有氣味活性，在發(fā)酵海帶中未被檢出?？傮w而言，酮類化合物因其OAV值總和較低，故對海帶整體氣味貢獻不大[20]。

芳香類主要來自于海泥和水體等外部環(huán)境，通過生物富集作用在海帶中積累，一般具有刺激性和石油味等不良風(fēng)味。采用最優(yōu)工藝發(fā)酵后，海帶中芳香類的OAV值總和顯著下降(達2.45)，其中聯(lián)苯作為該類唯一的氣味活性物質(zhì)貢獻顯著，占芳香類OAV總消降值的82%。

烴類因其自身閾值較大，故對海帶揮發(fā)性風(fēng)味貢獻較小。2-乙基呋喃屬含氧雜環(huán)類化合物，具有刺激性氣味，是海帶中另一種重要的氣味活性物質(zhì)，經(jīng)發(fā)酵后的海帶中，其濃度已降至降至閾值以下，不具氣味活性。三碘甲烷是原料海帶中唯一被檢出的含碘化合物，采用最優(yōu)工藝發(fā)酵后其未被檢出。

2.2.2 脫腥處理中海帶中氣味活性物質(zhì)變化

由附表1(kns.cnki.net/KCMS/detail/11.1802.TS.20200715.1751.008.html)和圖4可知，經(jīng)不同脫腥工藝處理后，海帶中10種氣味活性物質(zhì)的OAV消降值和消降率均>0，表明經(jīng)酵母發(fā)酵后，海帶自身氣味活性發(fā)生了降低。除2-辛烯醛和壬醛之外，其余8種氣味活性物質(zhì)的OAV消降效果均較為顯著，其中己醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的OAV消降值較大(最大消降值均>3，其中癸醛達18以上)，而己醛、庚醛、癸醛、2-庚酮和2-乙基呋喃的消降率較高(最高消降率均>40%，其中2-庚酮達100%)?？傮w而言，原料海帶經(jīng)不同發(fā)酵條件處理后脫腥效果均較好，但其中也存在一定差異性。比較圖4-a和圖4-d可知，當(dāng)酵母質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，發(fā)酵后海帶樣品的OAV消降值及消降率均最高，表明其脫腥效果最好；由圖4-b和圖4-e可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，海帶脫腥效果最佳；由圖4-c和圖4-f可知，當(dāng)發(fā)酵時間為120 min時，海帶腥味消減最顯著。

a-酵母質(zhì)量濃度對OAV消降值的影響;b-發(fā)酵溫度對OAV消降值的影響;c-發(fā)酵時間對OAV消降值的影響;d-酵母濃度對OAV 消降率的影響;e-發(fā)酵溫度對OAV消降率的影響;f-發(fā)酵時間對OAV消降率的影響圖4 不同脫腥工藝對海帶氣味活性物質(zhì)的OAV消降值的影響Fig.4 Effect of different deodorization processes on the OAV of Laminaria japonica 注：小寫字母不同代表各組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異(P<0.05)

2.3 脫腥處理后感官評分

酵母質(zhì)量濃度1.5 g/L時，海帶樣品感官評分升至最高的70.5分，此質(zhì)量濃度下，脫腥后海帶中揮發(fā)物的總質(zhì)量分數(shù)與OAV值總和均達最低值(146.42和54.79 ng/g)。主要原因可能是：0～1.5 g/L時，酵母質(zhì)量濃度逐漸升高，發(fā)酵作用逐步加強，海帶中的腥味物質(zhì)消降效果越顯著；但當(dāng)酵母質(zhì)量濃度>1.5 g/L，則可能引入不良發(fā)酵異味，導(dǎo)致感官評分下降。

發(fā)酵溫度28 ℃時，脫腥后海帶感官評分達到最高，而此溫度下脫腥后海帶樣品揮發(fā)物總濃度值和OAV總和均低于其他溫度組。分析原因是：在24～28 ℃時，酵母增殖速度隨溫度增大，海帶中的腥味物質(zhì)可能發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞或者經(jīng)生物合成、修飾等反應(yīng)導(dǎo)致其腥味特征消失；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至30 ℃(酵母菌的最適生長溫度)時，菌體可能大量增殖引入不良異味[21]，造成海帶樣品感官評分下降。

發(fā)酵時間120 min時，感官評分達到最大值，而揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)和OAV總和達到最小值，兩者可相互印證。在30～120 min內(nèi)，酵母菌快速增殖，腥味物質(zhì)經(jīng)消降或生物轉(zhuǎn)化作用而減少。隨著發(fā)酵時間達到150 min，增殖逐步進入穩(wěn)定期，菌體數(shù)量大量積累，酵母菌體與生成的次生代謝產(chǎn)物均可能造成海帶中異味物質(zhì)的增加，造成感官評分下降。

綜上所述，感官評分與揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)以及OAV總和變化規(guī)律具有較強一致性，分析其相關(guān)性發(fā)現(xiàn)(表1)，不同脫腥條件下，感官評分與揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)以及OAV總和的相關(guān)性(分別以RAB和RAC表示)總體較高，絕對值均>0.8，且存在|RAB|<|RAC|的規(guī)律，表明與揮發(fā)物質(zhì)量分數(shù)相比，OAV值與感官評分間的相關(guān)性更強。此外，無論是RAB還是RAC，均存在發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>酵母質(zhì)量濃度的規(guī)律，表明不同發(fā)酵時間海帶樣品感官評分與揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)和OAV總和間的相關(guān)性最好。

表1 發(fā)酵條件對感官評價的影響及其 相關(guān)性分析Table 2 Influence of fermentation conditions on sensory evaluation and the correlation analysis

3 結(jié)論

不同發(fā)酵條件下海帶樣品整體氣味輪廓均無重疊，區(qū)分度較好。從原料海帶中共檢出7大類42種揮發(fā)物，篩選得到以己醛為代表的10種氣味活性物質(zhì)。根據(jù)揮發(fā)物種類、總質(zhì)量分數(shù)和OAV總和，確定了海帶脫腥的最優(yōu)工藝：酵母質(zhì)量濃度1.5 g/L、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間120 min。所有氣味活性物中，己醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的OAV消降值較大；己醛、庚醛、癸醛、2-庚酮和2-乙基呋喃的消降率較高；2-辛烯醛和壬醛的消降效果不顯著。經(jīng)最優(yōu)工藝發(fā)酵后，海帶中揮發(fā)物種類減少18種，揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)降低148.77 ng/g，氣味活性值總和減少39.07，感官評分升至最大值70.5。無論何種發(fā)酵條件下，感官評分與OAV值總和間的相關(guān)性始終高于與揮發(fā)物總質(zhì)量分數(shù)間的相關(guān)性。