盧萌萌，任聰,2*，聶堯,2*，徐巖,2

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

從釀造方式來(lái)分，白酒可以分為窖泥依賴(lài)型與窖泥非依賴(lài)型。窖泥依賴(lài)型白酒主要包括濃香型、醬香型、鳳香型、芝麻香型、兼香型和特香型白酒等；窖泥非依賴(lài)型白酒主要包括清香型、老白干香型、米香型和豉香型白酒等。窖泥中富含多種多樣的微生物，如己酸菌、丁酸菌等，這些微生物多為厭氧菌，其代謝產(chǎn)生的脂肪酸、脂肪醇與酒醅中的乙醇、乳酸和乙酸等物質(zhì)反應(yīng)生成了種類(lèi)繁多的酯類(lèi)物質(zhì)，賦予窖泥依賴(lài)型白酒窖香濃郁、綿甜等風(fēng)味特征。在眾多窖泥依賴(lài)型白酒中，濃香型白酒的質(zhì)量與窖泥質(zhì)量的相關(guān)性最為密切，優(yōu)質(zhì)窖泥是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的重要決定因素之一，而影響窖泥質(zhì)量的根本因素為定植于其中生長(zhǎng)的窖泥微生物。此前有研究表明，窖泥中存在的微生物可至少歸類(lèi)于225個(gè)屬，其中至少31個(gè)屬為主要的高豐度微生物[1]。然而，除部分己酸菌和丁酸菌外，其余眾多窖泥微生物的具體物種信息及其在窖泥和釀造過(guò)程中的功能尚未可知。由ZHU等[2-3]分離于某濃香型白酒窖池中的梭菌綱微生物CPB6菌株，被鑒定為1株重要的產(chǎn)己酸菌；CHAI等[4-5]從窖泥中分離得到了多株梭菌綱下的產(chǎn)丁酸細(xì)菌。除梭菌綱微生物外，窖泥中還棲息著如擬桿菌綱、甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱等豐度較高的微生物，其中產(chǎn)甲烷菌被推斷為具有通過(guò)與產(chǎn)酸細(xì)菌進(jìn)行互營(yíng)代謝促進(jìn)己酸生成的功能[6]。

對(duì)于窖泥微生物的結(jié)構(gòu)和功能解析，可利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)解析窖泥微生物結(jié)構(gòu)，而廣泛采用的二代高通量測(cè)序技術(shù)因讀長(zhǎng)限制，一般僅能將微生物種類(lèi)精確鑒定到屬水平；對(duì)窖泥微生物的釀造功能解析需借助基于全基因組解析的宏基因組學(xué)技術(shù)，應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)的最大障礙在于提取完成的DNA較為困難，目前僅有少數(shù)報(bào)道通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)手段對(duì)窖泥微生物結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行解析[7]。富集培養(yǎng)方法是實(shí)現(xiàn)窖泥微生物全基因組結(jié)構(gòu)解析的重要途徑。然而現(xiàn)有的研究表明，實(shí)驗(yàn)室人工條件下富集得到的微生物菌群組成大多結(jié)構(gòu)單一，大量窖泥微生物仍然處于難以被富集和培養(yǎng)的狀態(tài)。這對(duì)全面研究窖泥微生物菌群在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的作用造成較大阻礙。

富集培養(yǎng)通常被作為環(huán)境微生物可培養(yǎng)化研究的首要步驟。為盡可能多地實(shí)現(xiàn)未培養(yǎng)窖泥微生物在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的可培養(yǎng)化，本研究采用經(jīng)過(guò)配方改進(jìn)的CGM[8]、NBM[9]以及MCI[10]三種培養(yǎng)基，對(duì)濃香型白酒窖泥菌群進(jìn)行富集。其中CGM培養(yǎng)基屬于富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，NBM和MCI屬于寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。隨后結(jié)合16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，對(duì)富集菌群結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，挑選出一種適合于最大程度還原窖泥樣品原位菌群種類(lèi)的富集培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn),寡培養(yǎng)條件對(duì)于最大程度富集獲取窖泥中的未培養(yǎng)微生物菌群具有重要的作用，為實(shí)現(xiàn)更多種類(lèi)的未培養(yǎng)窖泥微生物可培養(yǎng)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 富集樣品

富集用種泥來(lái)自于江蘇省某濃香型白酒酒廠(chǎng)窖池。

1.1.2 培養(yǎng)基組成及相關(guān)試劑

CGM培養(yǎng)基(g)：葡萄糖20，(NH4)2SO42，K2HPO41，KH2PO40.5，蛋白胨10，酵母粉10，MgSO4·7H2O 0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15，CaCl20.01，MnSO40.01，CoCl2·6H2O 0.002，ZnSO40.002，1 g/L的刃天青溶液1 mL，加蒸餾水定容至1 L，滅菌前調(diào)pH至7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

NBM培養(yǎng)基(g)：KNO31，酵母粉3，蛋白胨5，牛肉膏3，1 g/L的刃天青溶液1 mL，加蒸餾水定容至1 L，滅菌前調(diào)pH至7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

MCI培養(yǎng)基(mL)：礦質(zhì)元素溶液50，微量元素溶液1，B族維生素溶液5，NaHCO3溶液70，Na2SO4溶液20，三水合乙酸鈉5 g，酵母粉1 g，蛋白胨1 g，1 g/L的刃天青溶液1 mL。滅菌前調(diào)pH至7.4±0.2，121 ℃滅菌20 min。滅菌后將維生素溶液、NaHCO3溶液和Na2S溶液在厭氧條件下按比例添加至培養(yǎng)基內(nèi)，定容至1 L。

礦質(zhì)元素溶液母液(g)：KH2PO410，MgCl2·6H2O 6.6，NaCl 8，NH4Cl 8，CaCl21，添加蒸餾水定容至1 L。

微量元素溶液母液(g)：ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl20.03，硼酸0.3，CoCl2·6H2O 0.2，CaCl20.01，NiCl2·6H2O 0.02，鉬酸鈉0.03，F(xiàn)eCl2·4H2O 1.5，添加蒸餾水定容至1 L。

B族維生素溶液母液(mg)：煙酸20，鈷胺素20，鹽酸硫胺10，對(duì)氨基苯甲酸10，鹽酸吡哆醇50，泛酸鈣5，添加蒸餾水定容至1 L，過(guò)濾除菌。

NaHCO3溶液：NaHCO35 g，添加蒸餾水定容至100 mL，過(guò)濾除菌。

Na2S溶液：Na2S 3 g，添加蒸餾水定容至100 mL，121 ℃單獨(dú)滅菌20 min。

以上試劑中，酵母粉與蛋白胨購(gòu)于Oxoid公司，其余常規(guī)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；Forma 1029厭氧培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司；NanoDrop 8000蛋白核酸測(cè)定分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher NanoDrop技術(shù)公司；FE 20型pH計(jì)，瑞士Mettler Toledo公司；DNeasy土壤微生物基因組DNA提取試劑盒，德國(guó)Qiagen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥接種和菌群培養(yǎng)

CGM培養(yǎng)基：將培養(yǎng)基分裝至50 mL離心管中，隨后在厭氧條件下接種質(zhì)量濃度100 g/L的窖泥樣品，在37 ℃厭氧條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)。

NBM培養(yǎng)基：將培養(yǎng)基分裝至50 mL離心管中，隨后在厭氧條件下接種質(zhì)量濃度100 g/L的窖泥樣品，在37 ℃厭氧條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)。

MCI培養(yǎng)基：滅菌前將培養(yǎng)基等分至100 mL血清瓶?jī)?nèi)，滅菌后添加Na2S、NaHCO3和B族維生素溶液定容至100 mL，隨后在厭氧條件下接種質(zhì)量濃度100 g/L的窖泥樣品，在37 ℃厭氧條件下靜置培養(yǎng)。

1.2.2 宏基因組DNA提取

富集時(shí)序進(jìn)程樣品宏基因組DNA提取通過(guò)DNeasy土壤微生物基因組DNA提取試劑盒提取完成，操作步驟參考說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增子測(cè)序

本研究選取16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)CGM、NBM和MCI的富集樣品菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，擴(kuò)增引物為515FmodF(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806RmodR(5′-GGACTACNVGG-GTWTCTAAT-3′)[11-12]。對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行建庫(kù)，使用PE250策略在Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)的分析通過(guò)上海美吉生物制藥有限公司的i-sanger云平臺(tái)完成。使用FLASH進(jìn)行高質(zhì)量堿基和pair-end雙端reads拼接[13]。短于50 bp的序列通過(guò)使包含在QIIME(ver.1.9.1)[14]中的Trimmomatic移除。之后，使用Usearch 7.0[15]中的UPARSE對(duì)97%相似水平下的操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTU)進(jìn)行聚類(lèi)統(tǒng)計(jì)分析。將OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(ver.128)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息。

1.2.4 宏基因組測(cè)序

使用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)MCI培養(yǎng)基典型富集樣品的菌群結(jié)構(gòu)和功能信息進(jìn)行分析。建庫(kù)宏基因組的DNA由早期和中期富集樣品的DNA混合而成。宏基因組DNA的文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序由上海美吉生物制藥有限公司完成。通過(guò)NEXTFLXTM快速DNA-Seq試劑盒構(gòu)建400 bp的文庫(kù)，使用PE150策略在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)使用Seqprep和Sickle獲得高質(zhì)量pair-end雙端reads。通過(guò)使用Megahit[16]對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行多重混合拼接組裝，得到拼接效果最佳的序列。通過(guò)使用CDD-HIT[17]軟件對(duì)樣品中所有的預(yù)測(cè)基因序列進(jìn)行聚類(lèi)(默認(rèn)參數(shù)：90% identity，90% coverage),取每個(gè)類(lèi)別最長(zhǎng)的基因作為代表序列。構(gòu)建非冗余基因集。使用DIAMOND[18]中的BLASTP(BLAST Version 2.2.28+)[19]將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得物種注釋結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基富集條件下的菌群結(jié)構(gòu)差異

本研究旨在通過(guò)使用不同的培養(yǎng)方法探究最適于培養(yǎng)和富集窖泥微生物菌群的培養(yǎng)基條件。首先使用了培養(yǎng)梭菌較為常用的CGM培養(yǎng)基，擴(kuò)增子測(cè)序顯示CGM富集條件下相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌菌群僅歸屬到3個(gè)科，包括瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)和Clostridiaceae_1(圖1-a)。其中梭菌科微生物Clostridiaceae_1是此種富集培養(yǎng)條件下得到的相對(duì)豐度最高的類(lèi)群，豐度達(dá)到了79.33%，菌群結(jié)構(gòu)較為單一(圖1-a)。自然條件下的微生物通常生活在營(yíng)養(yǎng)缺乏,較為嚴(yán)苛的環(huán)境下，這些微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富,含有大量碳源、氮源的條件下則有可能難以生長(zhǎng)，較為貧瘠的培養(yǎng)條件則有可能獲得更多的物種多樣性[20-21]。以此為基礎(chǔ)，去除速效性碳源(葡萄糖)的NBM培養(yǎng)基被選擇用來(lái)對(duì)窖泥菌群進(jìn)行富集培養(yǎng)。NBM富集條件下相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌菌群歸屬到6個(gè)科，包括消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Family_ⅩⅢ、Clostridiaceae_1和Family_Ⅺ_o_Clostridiales(圖1-b)，其中梭菌綱微生物在富集菌群中仍占主導(dǎo)地位，比如Clostridiaceae_1和Family_Ⅺ_o_Clostridiales相對(duì)豐度分別達(dá)到了21.60%和45.15%(圖1-b)。結(jié)合之前的研究報(bào)道，釀造體系中的產(chǎn)己酸丁酸菌多屬于梭菌[3-4, 22-23]，可在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下富集，而NBM培養(yǎng)基中含有共計(jì)11 g/L的速效氮源成分，這或許是梭菌綱微生物仍在菌群結(jié)構(gòu)中占比較高的原因。隨后，我們采用不含速效碳源葡萄糖且將氮源質(zhì)量濃度(2 g/L)進(jìn)一步降低的MCI培養(yǎng)基來(lái)富集窖泥菌群。如圖1-c所示，MCI培養(yǎng)基富集培養(yǎng)條件下，科水平檢測(cè)到的菌群數(shù)量明顯增加，達(dá)到15個(gè)科，其中古菌2個(gè)科、細(xì)菌13個(gè)科。采用MCI培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，除常見(jiàn)梭菌科微生物外，其他窖泥微生物也明顯富集，如甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)和norank_c_BRH-C20a科是富集菌群中主要的主導(dǎo)菌群，相對(duì)豐度分別為10.90%、27.98%、15.10%和11.97%。上述結(jié)果表明，不含葡萄糖、降低氮源的寡營(yíng)養(yǎng)條件有利于窖泥菌群的富集，且能同時(shí)富集出細(xì)菌和古菌。

a-CGM富集菌群科水平結(jié)構(gòu);b-NBM富集菌群科水平結(jié)構(gòu);c-MCI富集菌群科水平結(jié)構(gòu)圖1 不同培養(yǎng)基富集條件下科水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Microbial community structures at family level under different enrichment culture conditions 注：相對(duì)豐度<1%的科合并到未分類(lèi)序列

2.2 MCI培養(yǎng)基富集時(shí)序進(jìn)程中的菌群動(dòng)態(tài)變化

由圖1可知，在MCI培養(yǎng)基富集條件下，所得到的菌群結(jié)構(gòu)中包括產(chǎn)甲烷古菌。為進(jìn)一步分析MCI培養(yǎng)基富集過(guò)程中的菌群動(dòng)態(tài)變化，分別接種來(lái)源于某濃香型酒廠(chǎng)不同窖池窖泥R1和R2，窖齡分別為4和10年，作為生物學(xué)重復(fù)?；跀U(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)2個(gè)生物學(xué)重復(fù)窖泥樣本在時(shí)序進(jìn)程中的菌群變化進(jìn)行分析。在MCI富集培養(yǎng)下，2個(gè)生物學(xué)重復(fù)的富集樣品中各自檢測(cè)得到27和32個(gè)原核生物科。其中有17個(gè)科在2個(gè)樣品中都能檢測(cè)到。因富集培養(yǎng)的窖泥接種質(zhì)量濃度100 g/L，在本研究中，某成功富集科(family)被定義為在任一生長(zhǎng)階段的富集體系中不低于其在對(duì)應(yīng)窖泥中相對(duì)豐度的10%的科。如圖2所示，在窖泥樣品和任意富集樣本中相對(duì)豐度為1%及以上的科被篩選顯示出來(lái)。

對(duì)于生物學(xué)重復(fù)1，窖泥中相對(duì)豐度為1%及以上的科為16個(gè)，包括普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Dysgonomonadaceae、Cloacimonadaceae、Family_XI_o__Clostridiales、Family_XIV、太陽(yáng)桿菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、互營(yíng)單胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Gracilibacteraceae、unclassified_c__Clostridia、Synergistaceae、Acholeplasmataceae、unclassified_Bacteria、甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)和甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)。除甲烷桿菌科、Cloacimonadaceae、Family_XIV和互營(yíng)單胞菌科4個(gè)科外，其他科均被成功富集出來(lái)，富集有效性為75%(12/16)。窖泥中相對(duì)豐度<1%的6個(gè)科，包括Clostridiaceae_1、消化球菌科、Methanomethylophilaceae、Lachnospiraceae、norank_p__Armatimonadetes和氨基球菌科(Acidaminococcaceae)，也被成功富集。此外，還有5個(gè)科包括芽孢桿菌科(Bacillaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Oligosphaeraceae，在窖泥中的豐度低于擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè)限，在窖泥中甚至無(wú)法檢出，但仍可被富集出來(lái)，其中Oligosphaeraceae在富集中相對(duì)期樣品中豐度甚至達(dá)到10.57%。

圖2 窖泥菌群經(jīng)MCI培養(yǎng)基富集后在不同階段原核微生物菌群結(jié)構(gòu)與種泥原核微生物菌群結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Comparation of microbial dynamics in typical enrichment cultures at different stages using MCI medium and the microbial community structure in pit muds at family level 注：相對(duì)豐度<1%的科合并到未分類(lèi)序列。R1表示窖泥樣本1;R2表示窖泥樣本2;4、8和12 d等表示富集的培養(yǎng)天數(shù);取樣為連續(xù)取樣

對(duì)于生物學(xué)重復(fù)2，窖泥中相對(duì)豐度為1%及以上的科為8個(gè)，包括Dysgonomonadaceae、norank_o__DTU014、動(dòng)性球菌科(Planococcaceae)、互營(yíng)單胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Thermoanaerobacteraceae、太陽(yáng)桿菌科(Heliobacteriaceae)、甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)。其中，Dysgonomonadaceae、互營(yíng)單胞菌科和太陽(yáng)桿菌科被成功富集，富集有效性為37.5%(3/8)。而窖泥中相對(duì)豐度<1%的13個(gè)科，包括理研菌科(Rikenellaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、Clostridiaceae_1、Clostridiales_Incertae_Sedis、Family_XIII、Gracilibacteraceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、SRB2、Family_XI_o__Clostridiales、甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)和Methanomassiliicoccaceae，均被成功富集。此外，還有11個(gè)科為窖泥中幾乎檢測(cè)不到的低豐度微生物，包括Bacteroidales_UCG-001、Cloacimonadaceae、纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)、norank_c__BRH-c20a、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、Oligosphaeraceae、norank_c__Berkelbacteria、norank_o__Candidatus_Moranbacteria、unclassified_Bacteria和Pedosphaeraceae，也被成功富集，其中norank_o__Candidatus_Moranbacteria在富集中期最高相對(duì)豐度達(dá)到15.06%。

上述富集分析表明，采用不同的窖泥作為種泥，使用MCI培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)均可富集到多樣性較高的菌群，富集得到的厭氧菌類(lèi)型與初始窖泥微生物種類(lèi)有關(guān)。而且使用這種寡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)方式不僅可以富集到窖泥中豐度較高的微生物，還能富集到窖泥中的低豐度微生物。這在其他環(huán)境微生物的富集培養(yǎng)研究中也得到類(lèi)似印證，如MU等[24]通過(guò)使用海水為主要基質(zhì)的寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)海洋微生物進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)富集培養(yǎng)可有效提高難培養(yǎng)微生物的豐度，從而達(dá)到檢測(cè)閾值，提高富集菌群的物種多樣性。同時(shí)，應(yīng)該注意到在富集過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化，如有些微生物在富集中期或后期相對(duì)豐度高于其他時(shí)期，比如生物學(xué)重復(fù)1富集樣品中的Thermoanaerobacteraceae和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)以及生物學(xué)重復(fù)2窖泥富集樣品中的Cloacimonadaceae、纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)和norank_o__Candidatus_Moranbacteria。這種現(xiàn)象也發(fā)生在其他類(lèi)型環(huán)境微生物的富集培養(yǎng)研究中[24-25]。在富集過(guò)程中，微生物結(jié)構(gòu)并非一成不變，說(shuō)明在后續(xù)分離純菌株的過(guò)程中，需要特別注意在不同生長(zhǎng)階段，目標(biāo)菌可能具有不同的豐度，并關(guān)注富集過(guò)程中的時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。

由圖2可知，在MCI富集培養(yǎng)條件下，R1窖泥樣品中甲烷菌群比例占原核菌群的19.26%，主導(dǎo)甲烷菌群為甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae，占比2.31%)和甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae，占比16.31%)；而在富集培養(yǎng)體系中，甲烷菌群比例僅為7.95%～9.85%，且主導(dǎo)甲烷菌變?yōu)榧淄樽拙?Methanosaetaceae，占比4.62%～8.23%)。R2窖泥樣品中甲烷菌群比例占原核菌群的62.76%，主導(dǎo)甲烷菌為甲烷桿菌科(34.31%)和甲烷微菌科(28.11%)；而在富集培養(yǎng)體系中，甲烷菌群比例下降至3.30%～4.89%，主導(dǎo)甲烷菌是甲烷八疊球菌科(1.92%～3.17%)。富集樣品的甲烷菌種類(lèi)及豐度都與窖泥中的甲烷菌有差異，碳源類(lèi)型與厭氧程度可能是導(dǎo)致這種差異的原因。本研究采用MCI培養(yǎng)基的最初目的為獲得產(chǎn)甲烷菌群，但卻意外發(fā)現(xiàn)采用該培養(yǎng)基同時(shí)可以富集得到豐富度較高的細(xì)菌菌群。之前的多項(xiàng)研究表明，梭菌綱微生物在窖泥微生物菌群中占據(jù)重要地位[26-27]，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法也更傾向于得到高豐度的梭菌綱微生物，但得到的菌群結(jié)構(gòu)較為單一[2-3]。而在本研究中，2個(gè)生物學(xué)重復(fù)富集樣品中分別檢測(cè)到11和15種梭菌綱微生物，包括太陽(yáng)桿菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、互營(yíng)單胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Lachnospiraceae、Clostridiaceae_1、Family_XI_o__Clostridiales、Gracilibacteraceae、消化球菌科(Peptococcaceae)、unclassified_c__Clostridia、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Family_XIV、norank_o__DTU014、Clostridiales_Incertae_Sedis、SRB2和Thermoanaerobacteraceae，所占比例范圍分別為22.13%～25.43%(生物學(xué)重復(fù)1)、18.84%～51.63%(生物學(xué)重復(fù)2)。此外，在富集樣品中也檢測(cè)到了采用CGM培養(yǎng)基和NBM培養(yǎng)基未能成功富集的擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)微生物，如生物學(xué)重復(fù)1富集樣品中的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和Dysgonomonadaceae，所占比例達(dá)到16.55%～43.08%；生物學(xué)重復(fù)2富集樣品中的Bacteroidales_UCG-001、Dysgonomonadaceae和理研菌科(Rikenellaceae)，所占比例達(dá)到33.87%～42.71%。此前有研究表明，擬桿菌門(mén)屬于對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較低的菌群[28-29]，與CGM(碳源20 g/L，氮源20 g/L)、NBM(氮源11 g/L)培養(yǎng)基相比，MCI培養(yǎng)基的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分(氮源2 g/L)較少，這或許符合了窖泥原位環(huán)境中某些寡營(yíng)養(yǎng)菌群的營(yíng)養(yǎng)需求。亦有研究表明，寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件可培養(yǎng)出未培養(yǎng)的、多樣性更豐富的微生物[30-31]，或許正是因?yàn)檫@種寡營(yíng)養(yǎng)條件抑制了優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌，如利用葡萄糖等速效碳源生長(zhǎng)的微生物，促使更多種類(lèi)的難培養(yǎng)微生物得以被富集。

2.3 宏基因組學(xué)分析典型富集菌群組成

通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)典型富集樣品(生物學(xué)重復(fù)1)進(jìn)行進(jìn)一步的菌群結(jié)構(gòu)分析。如圖3所示，在域水平，相對(duì)豐度>1%的類(lèi)群中，73.06%屬于細(xì)菌，26.67%屬于古菌。而擴(kuò)增子分析顯示，富集樣品中古菌菌群比例僅為8.68%，這表明使用針對(duì)16S rRNA基因V4可變區(qū)的515FmodF/806RmodR引物進(jìn)行擴(kuò)增子分析可能低估了古菌的豐度。在門(mén)水平，擴(kuò)增子測(cè)序可將菌群歸屬到擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、廣古菌門(mén)(Euyarchaeota)、黏膠球形菌門(mén)(Lentisphaerae)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)和未分類(lèi)門(mén)unclassified_Bacteria，而宏基因組測(cè)序技術(shù)并未檢測(cè)到黏膠球形菌門(mén)(Lentisphaerae)。在科水平，宏基因組學(xué)分析結(jié)果顯示所得序列僅可歸屬到11個(gè)科，少于擴(kuò)增子測(cè)序的分析結(jié)果(17個(gè)科)。其中，在宏基因組測(cè)序結(jié)果中，甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae，20.09%)和紫單胞菌科(Porphyromonadaceae，17.53%)為主要的主導(dǎo)菌群；擴(kuò)增子分析結(jié)果顯示，富集樣品中的主導(dǎo)菌群為Dysgonomonadaceae(25.15%)和理研菌科(Rikenellaceae，13.53%)，而主導(dǎo)甲烷菌甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)最高相對(duì)豐度僅可達(dá)到6.76%，遠(yuǎn)低于宏基因組學(xué)分析結(jié)果，再次表明擴(kuò)增子測(cè)序低估了古菌菌群的豐度。此外，值得注意的是，隨著分類(lèi)水平的提高，宏基因組和擴(kuò)增子測(cè)序的未分類(lèi)序列(others)的比例都越來(lái)越高，其中在科水平，宏基因組測(cè)序的未分類(lèi)序列比例高達(dá)34.33%，這是由于窖泥中的大部分細(xì)菌和古菌尚未在全基因組水平得到鑒定，目前的宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于窖泥微生物基因組結(jié)構(gòu)的解析度非常有限。

a-宏基因組域水平群落結(jié)構(gòu);b-擴(kuò)增子測(cè)序域水平群落結(jié)構(gòu);c-宏基因組門(mén)水平群落結(jié)構(gòu); d-擴(kuò)增子測(cè)序門(mén)水平群落結(jié)構(gòu);e-宏基因組科水平群落結(jié)構(gòu);f-擴(kuò)增子測(cè)序科水平群落結(jié)構(gòu)圖3 富集樣品擴(kuò)增子測(cè)序與宏基因組域水平、門(mén)水平和科水平的菌群結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.3 Comparison of the microbial compositions of a typical enrichment culture between 16S rRNA gene amplicon sequencing and metagenomic sequencing at domain, phylum and family levels 注：相對(duì)豐度<1%的菌群合并到未分類(lèi)序列

用宏基因組數(shù)據(jù)對(duì)富集菌群物種信息進(jìn)行注釋?zhuān)绫?所示。

表1 宏基因組學(xué)解析富集樣品中微生物種水平結(jié)構(gòu)Table 1 Microbial structure of a typical enrichment culture at species level by metagenomics

相對(duì)豐度>0.5%的菌群可注釋到15個(gè)物種，其中有4種產(chǎn)甲烷古菌得到注釋?zhuān)嫉?2.34%，并可確定富集樣品中的主體產(chǎn)甲烷菌為Methanosaetaconcilii(19.62%)。除此之外，得到注釋的細(xì)菌比例僅為23.92%，而未得到分類(lèi)注釋的序列比例高達(dá)53.75%，包括部分未知的古菌和大量的細(xì)菌。因此依靠宏基因組技術(shù)雖然可以獲得部分物種信息，但由于未培養(yǎng)微生物大量存在，而注釋用的數(shù)據(jù)庫(kù)信息不完善，對(duì)物種信息注釋和功能研究不可避免地造成阻礙[7]。今后的窖泥微生物研究仍然需要重點(diǎn)分離與解析未培養(yǎng)古菌和細(xì)菌的基因組結(jié)構(gòu)。本研究建立的寡培養(yǎng)方法為全面解析窖泥微生物的種類(lèi)構(gòu)建起從免培養(yǎng)技術(shù)到可培養(yǎng)技術(shù)的橋梁。

3 結(jié)論

本研究確立了寡營(yíng)養(yǎng)方法為富集未培養(yǎng)白酒釀造微生物菌群的較優(yōu)方式，這種培養(yǎng)方式不僅可以有效維持和培養(yǎng)窖泥原位菌群，而且使一些低豐度菌群也得到富集。本研究建立的寡培養(yǎng)方法適用于除己酸菌和丁酸菌以外的未培養(yǎng)窖泥微生物的可培養(yǎng)化研究。結(jié)合本研究建立的寡培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)富集菌群進(jìn)行宏基因組分析，可以得到部分準(zhǔn)確的物種注釋信息，提供了深入探索窖泥微生物釀造功能的技術(shù)手段。后續(xù)研究需進(jìn)一步對(duì)窖泥微生物的可培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行深入研究，以突破高通量測(cè)序的技術(shù)局限，更加準(zhǔn)確地對(duì)白酒釀造窖泥微生物進(jìn)行物種注釋?zhuān)瑥亩馕鼋涯鄥捬蹙尼勗旃δ芎彤a(chǎn)風(fēng)味功能，為提高窖泥依賴(lài)型白酒品質(zhì)的厭氧微生物應(yīng)用技術(shù)提供理論支撐。