武翠梅，王改青，要振佳

腦出血是卒中的一種亞型，其發(fā)病率、致死率及致殘率均較高，會帶來一系列原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷，導(dǎo)致后期預(yù)后不良[1]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫功能的主要細胞，廣泛分布于大腦各個區(qū)域，占成人神經(jīng)膠質(zhì)細胞群的10%[2-3]，在腦出血、腦梗死、神經(jīng)退行性疾病等疾病中起著至關(guān)重要的作用，是目前研究的熱點之一。在生理情況下，小膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織穩(wěn)態(tài)受到干擾時，小膠質(zhì)細胞被激活以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2-4]。小膠質(zhì)細胞從靜息狀態(tài)向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變是一個動態(tài)過程，活化的小膠質(zhì)細胞根據(jù)其表面標(biāo)志物及功能的不同，分為兩種表型，M1型（促炎型/有害型）和M2型（抗炎型/保護型），二者細胞膜均高度表達Iba1[5-6]。M1通過經(jīng)典途徑活化形成，細胞膜上表達標(biāo)志物CD80、CD86等，并分泌炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，加重腦出血后腦損傷；M2經(jīng)替代途徑活化而成，胞膜上表達特征性標(biāo)志物CD206、CD23等，具有較強的吞噬能力，能夠吞噬受損神經(jīng)細胞和組織碎片，修復(fù)創(chuàng)傷，同時釋放一些神經(jīng)保護因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）[7-8]。目前有研究探討了腦出血后M1型小膠質(zhì)細胞抑制或促進M2型小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的潛在方法和可能機制[9-10]，但小膠質(zhì)細胞活化后不同亞型在腦出血后不同時間段的變化規(guī)律尚不完全清楚。因此，本實驗觀察腦出血后不同時間段活化后小膠質(zhì)細胞不同亞型的動態(tài)變化，探討腦出血后血腫的內(nèi)源性可能清除機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與耗材

1.1.1 實驗動物 健康雄性ICR小鼠（體質(zhì)量25～30 g），購于山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。分籠飼養(yǎng)，食物與水充足，12 h/12 h晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)溫度維持在25±1 ℃，濕度適中。

1.1.2 抗體 ①蛋白免疫印跡：兔抗-TNF-α（武漢愛博泰克生物公司），兔抗-IL-6、兔抗-IGF-1（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔抗-BDNF單克隆抗體、兔抗-β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；②免疫熒光檢測：羊抗-Iba1多克隆抗體、倉鼠抗-CD80單克隆抗體、兔抗-CD206多克隆抗體、羊抗倉鼠IgG H&L二抗（Alexa Fluor?647）（美國Abcam公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的驢抗羊二抗、CoraLite594標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 其他耗材 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶生物科技有限公司），含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片劑（北京索萊寶生物科技有限公司），腦立體定位儀（北京眾實嘉合生物科技有限公司），數(shù)字切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司）。

1.2 實驗分組 將48只ICR小鼠隨機分為假手術(shù)組（24只）與腦出血組（24只），各組按術(shù)后不同時間點又分為1 d、3 d、7 d三個時間點，每組每個時間點8只。各時間點先參照改良Garcia評分量表進行神經(jīng)功能缺損評分，然后灌注取腦，其中5只進行蛋白免疫印跡，3只進行免疫熒光染色。

1.3 小鼠腦出血模型制備 用5%水合氯醛（0.01 mL/g）對小鼠行腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，將頭背側(cè)皮膚消毒、備皮，頭正中切口，暴露顱骨，用顱骨鉆于前囟后0.9 mm，中線右1.5 mm處鉆一直徑約1 mm圓孔，用微量注射器在深4 mm處（尾狀核位置）緩慢注射0.5 U Ⅳ型膠原酶，停針15 min后緩慢退針，醫(yī)用無菌骨臘封閉鉆孔，消毒、縫合皮膚后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組注射等量生理鹽水。待小鼠術(shù)后清醒參照Rosenberg標(biāo)準評分法[11]判定腦出血模型成功與否，無神經(jīng)功能缺損為0分，評分在1分以上視為腦出血造模成功，評分越高神經(jīng)功能損傷越重，造模失敗或?qū)嶒炛型舅劳龅男∈筇蕹龜?shù)據(jù)后予以重新造模補充并統(tǒng)計。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分 采用改良Garcia評分量表[12]進行行為學(xué)評分，該量表分為自發(fā)活動、肢體運動情況、前肢伸展情況、金屬網(wǎng)狀壁攀爬、軀干觸碰反應(yīng)、觸須反應(yīng)等6項，最高18分，最低3分，評分越低則神經(jīng)功能損傷越重。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測TNF-α、IL-6、BDNF、IGF-1蛋白表達 腹腔麻醉小鼠后開胸，經(jīng)心臟灌注預(yù)冷PBS緩沖液，斷頭取腦，冰上操作取血腫周圍腦組織，提取組織蛋白，按照組織10 mg加入100 μL裂解液，勻漿器勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心2 min后取上清液。取部分上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，按照蛋白100 μL加上樣緩沖液（5X）20 μL的比例配制，沸水煮5 min。按每孔30 μg蛋白上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉液室溫封閉2 h，TBST（tris buffered saline tween-20）緩沖液漂洗后，一抗TNF-α（1∶2000）、IL-6（1∶2000）、BDNF（1∶1000）、IGF-1（1∶2000），4 ℃孵育過夜；二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗。加入顯色劑進行化學(xué)發(fā)光，同時測定β-actin（1∶5000）表達作為參照，用Image lab 6.0軟件進行半定量分析。

1.6 免疫熒光檢測 腹腔麻醉小鼠后經(jīng)心臟灌注冰PSB緩沖液和4%多聚甲醛，于冰上斷頭取腦。將腦組織置于4%多聚甲醛，4 ℃過夜，然后在相同溫度下于20%及30%蔗糖PBS緩沖液中進行梯度脫水。OCT（一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物）固定包埋后于-20 ℃下行冰凍切片，厚度10 μm，PBS溶液漂洗5 min×3次，山羊血清封閉30 min，同時孵 M1（抗Iba1抗體1∶200，CD80 1∶200）和M2（抗Iba1抗體1∶200，CD206 1∶200）一抗后移至4 ℃，過夜后移至室溫復(fù)溫15 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，室溫、避光條件下孵二抗（驢抗羊IgG 1∶50，羊抗兔IgG 1∶300，羊抗倉鼠IgG 1∶600）1 h，避光漂洗（方法同上），滴加DAPI，蓋蓋玻片，數(shù)字切片掃描儀下觀察切片。每張切片隨機選取3個視野進行拍照，每個視野含紅、綠、藍三種熒光，分別代表CD80/CD206、Iba1、細胞核。采用盲法計數(shù)，每組三張照片中同時有該細胞則符合計數(shù)條件，否則舍去。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0及GraphPad統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析及圖表繪制。計量資料符合正態(tài)分布采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內(nèi)不同時間點比較采用單因素方差分析，不滿足方差齊性時，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組小鼠無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，1 d、3 d、7 d各時間點Garcia評分均為18分；腦出血組各時間點為7.25±2.43分、10.50±1.31分和13.25±0.88分。與假手術(shù)組相比，腦出血組各時間點Garcia評分均下降（均P＜0.01）；1 d時神經(jīng)功能缺損最重，各時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）（圖1）。

2.2 兩組小鼠TNF-α、IL-6的蛋白表達 假手術(shù)組1 d、3 d、7 d各時間點的TNF-α及IL-6的蛋白表達量無明顯變化。與假手術(shù)組相比，腦出血組各時間點的TNF-α及IL-6的蛋白表達量均增多（均P＜0.01）；且以腦出血3 d時最明顯，與1 d、7 d相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），而1 d與7 d相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

2.3 兩組小鼠BDNF、IGF-1的蛋白表達 假手術(shù)組1 d、3 d、7 d各時間點的BDNF及IGF-1的蛋白表達量無明顯變化。與假手術(shù)組相比，腦出血組各時間點BDNF及IGF-1的蛋白表達量均增多（均P＜0.01）；腦出血組3 d及7 d的BDNF及IGF-1蛋白表達量與1 d相比均增多（均P＜0.01），而3 d與7 d相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

2.4 腦出血后M1、M2型小膠質(zhì)細胞的動態(tài)變化 免疫熒光染色顯示，假手術(shù)組各時間點幾乎看不到活化的小膠質(zhì)細胞，腦出血后1 d時M1型高于M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量（38.33±1.53vs23.00±3.00，P=0.01）；3 d時M1型的數(shù)量同樣高于M2型（66.33±3.06vs57.33±2.52，P=0.02）；7 d時M1型低于M2型（33.67±1.15vs52.33±0.58，P＜0.01）（圖4～圖5）。

3 討論

圖1 兩組小鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分

圖2 兩組小鼠不同時間點TNF-α、IL-6蛋白表達水平

圖3 兩組小鼠不同時間點BDNF、IGF-1蛋白表達水平

小膠質(zhì)細胞最先對急性腦損傷產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細胞。研究證實，小膠質(zhì)細胞與多種疾病的病理過程有關(guān)，比如腦梗死、帕金森病、阿爾茲海默癥等[13-14]。在正常情況下，小膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)，呈“分枝狀”。腦出血后，小膠質(zhì)細胞迅速做出反應(yīng)，胞體增大，分枝縮短，呈“變形蟲樣”，吞噬受損細胞或組織碎片。小膠質(zhì)細胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變呈動態(tài)演變過程，不同形態(tài)扮演不同的角色，發(fā)揮不同的作用。有證據(jù)顯示，小膠質(zhì)細胞有兩種活化形式，M1型和M2型。M1型主要分泌大量促炎因子，如TNF-α和IL-6，進一步加重腦出血后腦損傷，其特異性表達CD80、CD86和組織相容性復(fù)合體Ⅱ等分子。M2型特異性表達CD206、精氨酸酶-1、IL-10等，釋放IGF-1和BDNF，保護腦組織對抗損傷。

圖4 兩組小鼠不同時間點兩種小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)（免疫熒光×400）

圖5 腦出血組不同時間點兩種小膠質(zhì)細胞數(shù)量變化

國內(nèi)外對腦出血后小膠質(zhì)細胞活化的動態(tài)變化的研究較少。本實驗中，發(fā)現(xiàn)在腦出血急性期（1～3 d）M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著增加，出血后第3天達到高峰，同時，炎癥因子TNF-α、IL-6的蛋白質(zhì)表達水平升高，其變化趨勢同M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量變化基本一致，而M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)在3～7 d明顯增多，神經(jīng)保護因子BDNF和IGF-1蛋白表達水平也同步上升。Lan等[15]認為在腦出血4 h即能檢測到M1，而M2在腦出血后24 h后開始出現(xiàn)，腦出血第1天M1占主要地位；出血第3天M1數(shù)量仍在上升，但M1占活化小膠質(zhì)細胞的比例開始下降，M2所占比例開始上升，作者認為M1型小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)化是發(fā)生在腦出血前3 d，與本研究結(jié)果基本一致。而Wan等[16]的研究發(fā)現(xiàn)M1在腦出血后4 h顯著增加并達到峰值，在第3天時仍保持在較高水平，而在第7天開始下降；M2的出現(xiàn)晚于M1，在腦出血后24 h達到峰值，后開始下降直至第7天，與本研究相左，可能是由于實驗分組、模型制備方法及抗體試劑不同等造成。

在腦出血急性期（1～3 d），紅細胞破裂后釋放出大量血紅蛋白到組織間隙，血紅蛋白進一步分解產(chǎn)生血紅素、一氧化碳及鐵離子，這些有毒代謝產(chǎn)物可以強烈激活小膠質(zhì)細胞，使其極化為M1型并產(chǎn)生大量炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血腫周圍組織損傷，大量神經(jīng)細胞死亡和血腦屏障破壞，使腦水腫加重，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損嚴重。在腦出血后期（7 d），M2型小膠質(zhì)細胞占優(yōu)勢，M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量相對較少，同時M2型小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物BDNF、IGF-1蛋白表達水平上調(diào)。在該階段，血腫基本處于穩(wěn)定期，機體需要吞噬能力強并能促進組織修復(fù)的細胞參與腦損傷后的組織修復(fù)。M2型小膠質(zhì)細胞能夠強力吞噬紅細胞和受損組織碎片，并分泌BDNF與IGF-1，促進神經(jīng)再生和神經(jīng)元存活，有利于腦功能恢復(fù)，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。

綜上所述，M1型（促炎型）小膠質(zhì)細胞和M2型（抗炎型）小膠質(zhì)細胞相伴產(chǎn)生，二者在腦出血后第3天同時達到高峰，其后以M2型小膠質(zhì)細胞為主；提示M1型小膠質(zhì)細胞可能與腦出血后早期水腫有關(guān)，而M2型小膠質(zhì)細胞可能與腦出血后神經(jīng)修復(fù)有關(guān)。于腦出血早期干預(yù)M1型小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)變對于促進血腫清除，減輕早期腦出血后水腫形成，促進神經(jīng)功能恢復(fù)可能具有重要意義，尚需進一步實驗明確其潛在的臨床價值。本研究的不足之處在于對于指標(biāo)檢測時間點的劃分還不夠細致，檢測指標(biāo)的選擇還有待于進一步提升，為探明腦出血后繼發(fā)性腦損傷機制和尋找有效的干預(yù)措施，后續(xù)將繼續(xù)進行創(chuàng)新研究。